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三叶半夏的2种病毒检测
目的:研究我国主产地栽培及野生三叶半夏的2种病毒病害发生情况和病毒种类.方法:症状观察法,DAS-ELISA及RT-PCR.结果与结论:侵染我国半夏的病毒主要为黄瓜花叶病毒CMV(cucumber mosaic virus)的天南星科株系和大豆花叶病毒SMV(soybeen mosaic virus)的天南星科株系,后者与以前报道的芋花叶病毒DSMV(dasheen mosaic virus)和SMV都有血清学阳性反应.人工栽培的三叶半夏普遍受到这2种病毒的侵染.其中,在早春检测的浙江宁波栽培半夏21个样品中CMV与SMV的检出率分别为71.4%和14.3%,浙江萧山栽培半夏18个样品中的检出率分别为100%和44.4%;河北栽培半夏21个样品中的检出率分别为61.9%和33.3%;安徽栽培半夏12个样品中的检出率分别为50.0%和41.7%;四川栽培半夏12个样品中2种病毒的检出率均为16.7%;北京栽培半夏16个样品中SMV的检出率为31.3%,未检测到CMV.25个来自全国各地的野生三叶半夏样品中CMV和SMV的平均检出率为20.0%.
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北京地区侵染菘蓝的黄瓜花叶病毒分子鉴定
为了鉴定中国医学科学院药用植物研究所栽培地中菘蓝花叶病样品中可能的病毒,采用反转录(reverse transcription,RT)-PCR方法,以马铃薯Y病毒属Potyvirus、马铃薯卷叶病毒属Polerovirus和烟草花叶病毒属Tobamovirus的通用检测引物,蚕豆萎蔫病毒2号(broad bean wilt virus 2,BBWV2)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)的特异检测引物进行分子检测.结果表明,用CMV特异引物扩增到1条657个核苷酸(nt)的条带,测序后经BLAST分析发现,该条带与CMV-Vi的核苷酸相似度高达99％,氨基酸相似度为100％,命名为CMV菘蓝分离物(CMV-It).根据CMV CP基因的核苷酸序列构建系统发育进化树表明,CMV-It与CMV-K分离物的亲缘关系较近,属于CMV I亚组.该研究首次用RT-PCR方法鉴定了菘蓝花叶病样品被CMV侵染,并分析了其CP基因序列特征,为菘蓝病毒病的研究及田间防治提供了依据.
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CMV抑制PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性
以前曾报道用RNA介导的抗病毒策略,获得了高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVyNCP)的转基因烟草,并对T1、T2代转基因植株进行了遗传和抗病性分析[1].此次以T3代转基因植株为试验材料,在筛选高度抗病植株并证明其抗病性是基于转基因沉默的基础上,采用Northern杂交的方法,证明CMV侵染抑制了转基因植株中PVYNCP基因的沉默,而且CMV对PVYNCP基因沉默的抑制部位是发生在接种后的新生叶上,接种叶及其下部叶片中PVyN CP基因沉默则未受到影响.采用ELISA方法对CMV+PVyN复合接种的转基因植株进行PVyN检测,结果表明,接种叶及下部叶没有检测到PVyN,植株叶片对PVyN表现为抗病.而在CMV接种后植株新生叶中则检测出了高滴度的PVYN,植株叶片对PVYN表现为感病.该文报道了在表达PVYNCP基因的RNA介导抗性转基因植株中,异源病毒侵染抑制了转基因的沉默,并导致转基因植株的抗病性丧失.
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香蕉线条病毒病研究进展
香蕉是重要的经济作物和粮食作物,广泛种植于热带、亚热带地区.在我国的广东、福建、海南、广西和云南等地均有大面积种植,产销量一直居南方四大水果之冠.然而,近年来,许多病毒病害成为香蕉生产发展的主要限制因素,主要包括香蕉束顶病毒(banana bunchy top virus,BBTV)、香蕉线条病毒(banana streak virus,BSV)、香蕉苞片花叶病毒(banana bract mosaic virus,BBrMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)等引起的病害.
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黄瓜花叶病毒衣壳蛋白基因转化辣椒研究
黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)的普遍发生和严重危害是辣椒生产上的一个重要限制因素,寻求新的防治方法是当前辣椒生产上的当务之急.我们在南方香蕉花叶病的调查研究中共鉴定了三种CMV株系[1,2,3],并将其优势株系CMV-BS的衣壳蛋白(coat protein,CP)基因转入了土尔其(Turkish)烟、本生烟(Benthemiana)[4]和广东两种烤烟(G28和K326)[5],对其后代的检测表明,表达CMV-BS株系CP基因的植株具有较为广谱的抗病毒能力.因此我们利用农杆菌双元载体系统将CMV-BS株系的CP基因转化入了辣椒.
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豇豆病毒病病原的分子鉴定
为澄清浙江省豇豆病毒病病原及其分类,采用马铃薯Y病毒属通用引物Sprimer扩增了浙江豇豆线状病毒基因组3′-末端序列.同时又根据已知CMV RNA3序列设计引物pCMV-44-63/1200-1181,扩增了混合侵染的CMV-ZJ运动蛋白基因全序列.外壳蛋白氨基酸序列分析表明,病样中仅存在一种线状病毒(CV-ZJ),该病毒与一泰国豇豆蚜传花叶病毒(CABMV)具有高的同源性(98.6%),与花生条纹病毒(PStV)、石斛花叶病毒(DeMV)、赤豆花叶病毒(AZMV)、黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)和菜豆普通花叶病毒(BCMV)分离物间的同源性为88.5%～94.4%,而与其它CABMV分离物的同源性均低于70%.进化树分析表明,PStV、AZMV、DeMV、BlCMV和BCMV为同种异名,应统称为BCMV,而CABMV为另一种病毒;CV-ZJ和泰国CABMV分离物应分类为BCMV豇豆株系.CMV-ZJ的运动蛋白序列分析表明,该分离物属于CMV亚组Ⅰ,与其它分离物氨基酸序列同源性为93.1%～97.8%.
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药用植物柴胡病毒病病原物的分子鉴定
利用非序列依赖性扩增(Sequence independent amplification,SIA)方法对所采柴胡病样进行分子鉴定.序列测定及分析发现,伴有花叶症状的柴胡受到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)的复合侵染.为明确柴胡CMV分离物(CMV-SXCH)和柴胡BBWV2分离物(BBWV2-CH)的分类地位,进一步克隆CMV-SXCH的CP、MP和BBWV2-CH的LCP、SCP;序列比对发现,CMV-SXCH与CMV亚组ⅠB中株系xJ2相似性高,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.1％、99.5％;BB-WV2-CH与BBWV2中的K株系相似性高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.4％、99.2％.系统进化树分析表明,CMV-SXCH与大多数CMV中国分离物聚类为一簇,同属于CMV亚组ⅠB;BBWV2-CH与BBWV2韩国K株系聚类为一簇,亲缘关系近.
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丹参脱病毒及组培快繁技术研究
丹参Salvia miltiorrhiza Bge.为唇形科鼠尾草属多年生草本药用植物,为常用大宗中药材,主治心血管系统疾病,具有活血祛瘀、消肿止痛、养血安神的功能[1].近年来研究表明,丹参可有效地抑制体外肿瘤细胞的增殖,能高效拮抗乙肝病毒核心抗原(HBeAg),有较好的抗艾滋病毒(HIV)作用[2].一系列对重大疾病有疗效的丹参新药的研制开发,致使丹参用量不断增加,种植面积不断扩大,已成为国际市场重要的药材之一.前期研究发现大田种植丹参,普遍感染黄瓜花叶病毒[3],该病田间发病率高,有些田块高达60%以上,引起植株退化,表现为卷叶、皱缩、黄化、脉间失绿、矮化等典型症状,感病植株根系变小,严重影响了丹参的产量和品质,为此开展了丹参脱病毒技术研究.
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丹参病毒病病原鉴定研究
目的鉴定我国中草药丹参病毒病的病原及其种类.方法从自然感染引起花叶、矮化、褪绿和斑驳的丹参植株上分离病毒病原,进行生物学接种、电镜观察、双抗体夹心酶联免疫吸附测定、逆转录聚合酶链式反应及基因克隆和序列分析.结果通过指示植物症状、电镜下病毒粒体形状和血清学反应发现病毒分离物与黄瓜花叶病毒有较近的亲缘关系,初步将该病毒分离物鉴定为黄瓜花叶病毒.通过逆转录聚合酶链式反应及基因克隆和序列分析,证明该病毒分离物为一个黄瓜花叶病毒新株系.结论感染丹参的病毒病原为黄瓜花叶病毒,这是首次在我国中草药丹参上发现黄瓜花叶病毒.
关键词： 丹参 黄瓜花叶病毒 电镜观察 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 逆转录聚合酶链式反应 基因克隆 序列分析 -
黄瓜花叶病毒2b蛋白在大肠杆菌中的表达及抗血清制备
从黄瓜花叶病毒(CMV)中提取总RNA,通过反转录-PCR(RT-PCR)扩增得到其运动蛋白2 b基因,将扩增产物克隆到pMD-18T载体上.DNA序列分析表明,所得到2 b基因全长为303 bp与已发表CMV序列相同.将目的片段亚克隆到表达载体pET-30 a上,并在大肠杆菌JM109诱导表达,诱导9 h后,融合蛋白表达量大.经SDS-PAGE检测,融合蛋白以可溶形式存在.制备的抗血清,效价为1:4 000.
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百合病毒的DNA芯片检测技术研究
根据已知的黄瓜花叶病毒,百合无症病毒、百合斑驳病毒基因核苷酸序列,设计引物和探针,制备寡核苷酸芯片.用Cy3标记核苷酸引物,不对称RT-PCR扩增产物与芯片上的寡核苷酸探针杂交,荧光扫描仪检测并分析信号.研究制备的基因芯片能够检测侵染百合的3种重要病毒核酸的特异性荧光信号,该项技术具有特异、灵敏、快速的优点.
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不同CMV分离物侵染寄主的超微结构变化
应用电镜观察了黄瓜花叶病毒CMV不同分离物侵染寄主的细胞超微结构变化.来自一串红(Salvia splendens)的不含卫星RNA分离物M-22侵染心叶烟,病毒粒子散布于细胞质,在液泡中形成大片病毒粒子结晶,液泡膜边缘产生小泡结构,完整的病毒粒子穿过胞间连丝在细胞间运转,胞间连丝中央部分有扩张现象.自然感染三生烟的含坏死卫星RNA分离物8-S1侵染普通烟,病毒粒子分散于细胞质,在液泡中未观察到结晶体,叶绿体产生囊泡结构,部分病毒粒子处在叶绿体空泡中.田间寄主上受8-S1侵染的三生烟细胞质中分布着大量球形病毒粒子,叶绿体也产生含有病毒粒子的囊泡结构.表明含有卫星RNA和不含卫星RNA的CMV分离物引起的细胞病变特征存在差别,可能是CMV卫星RNA参与病理变化的依据之一.
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马铃薯Y病毒N株HC-pro基因的序列分析与表达
马铃薯Ｙ病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯Ｙ病毒属(Potyvirus)的典型成员,是烟草、马铃薯和辣椒等茄科作物病毒病的主要病原之一,分布于世界各地.近年烟草上的 PVY在全国范围内特别是陕西、黄淮和东北烟区流行呈上升趋势,且以PVY坏死株系（PVY-N)为主,重病田发生率达40%以上,并常与烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒混合侵染,严重影响烟草品质造成巨大的经济损失.
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侵染生姜的黄瓜花叶病毒检测试剂盒的研制
目的:研制出可以检测侵染生姜的黄瓜花叶病毒试剂盒.方法:先采用RT-PCR法检测侵染生姜的黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒,选择仅仅含黄瓜花叶病毒的生姜叶片,采用均浆和高速离心的方法提取黄瓜花叶病毒,通过12％ SDS-PAGE和5％～20％梯度SDS-PAGE二次制备电泳的方法分离出黄瓜花叶病毒的外壳蛋白CP,将含CP的聚丙烯酰胺凝胶磨细后免疫小鼠,获得抗血清.对抗血清进行质量的检测,特异性检查采用Western blot方法,结合性采用ELISA方法,合格抗血清通过亲和层析获得IgG,经过浓缩、透析后与甘油混合获得试剂盒.结果:抗血清中的IgG仅仅与黄瓜花叶病毒的CP结合,抗血清中的IgG能够结合天然黄瓜花叶病毒颗粒.结论:该试剂盒能够检测生姜叶片中的黄瓜花叶病毒.
