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丹参病毒病病原鉴定研究
目的鉴定我国中草药丹参病毒病的病原及其种类.方法从自然感染引起花叶、矮化、褪绿和斑驳的丹参植株上分离病毒病原,进行生物学接种、电镜观察、双抗体夹心酶联免疫吸附测定、逆转录聚合酶链式反应及基因克隆和序列分析.结果通过指示植物症状、电镜下病毒粒体形状和血清学反应发现病毒分离物与黄瓜花叶病毒有较近的亲缘关系,初步将该病毒分离物鉴定为黄瓜花叶病毒.通过逆转录聚合酶链式反应及基因克隆和序列分析,证明该病毒分离物为一个黄瓜花叶病毒新株系.结论感染丹参的病毒病原为黄瓜花叶病毒,这是首次在我国中草药丹参上发现黄瓜花叶病毒.
关键词： 丹参 黄瓜花叶病毒 电镜观察 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 逆转录聚合酶链式反应 基因克隆 序列分析 -
镍接触工人中Cap43蛋白的过表达:一个潜在的筛查指标
目的 通过检测钙激活蛋白43(Cap43)在镍接触工人尿液及血清中的蛋白表达情况,探讨Cap43表达在镍接触人群与非镍接触人群之间有无差异,及其表达高低与镍接触检体标本之间的关系.方法 采用双抗夹心ELISA法检测150例镍接触工人[尿镍超标(>0.17 μmol/ml)17例,尿镍未超标133例]及10例正常人群尿液及血清中Cap43的表达.结果 尿液中Cap43的表达:尿镍超标组为(1.138±0.230)ng/ml,尿镍未超标组为(0.987±0.098)ng/ml,正常人群组为(0.609±0.012)ng/ml.血清中Cap43的表达:尿镍超标组为(2.4145±0.3475)ng/ml,尿镍正常组为(1.5614±0.5101)ng/ml,正常人群组为(1.2127±0.4135)ng/ml.结论 Cap43表达与镍接触直接相关,尿中Cap43含量高低与血清中Cap43含量有正相关关系(r=0.7755,P<0.01),Cap43检测应以血清标本为宜,本实验结果 为Cap43蛋白作为镍接触人群一个普查和疾病预防指标提供了有力的依据.
关键词： 镍 钙激活蛋白43 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 血清 尿液 -
Sf9昆虫细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立
目的 建立Sf9昆虫细胞宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量双抗体夹心ELISA检测方法.方法 从Sf9昆虫细胞中提取总蛋白,免疫家兔,制备兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体,经辛酸-硫酸铵沉淀和CL-4B层析柱纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性;用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,采用改良过碘酸钠法将HRP酶标记至纯化的抗体上作为酶标抗体,采用方阵滴定法确定双抗体夹心ELISA方法的适工作条件.确定该方法的佳线性范围及低检测限,验证该方法的准确度及精密度.将表达戊型肝炎ORF2基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞,收获病毒培养上清,制备3批纯化的重组蛋白,用建立的方法检测纯化过程中HCP含量的变化,验证其在纯化工艺中的适用性.与商品化试剂盒进行比较,检测两种方法的灵敏度及在制品中的适用性.结果 纯化后的兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体纯度达90％以上,抗体效价为1∶10000,可与Sf9细胞蛋白特异性结合.建立的双抗体夹心法ELSA方法佳抗体包被浓度为20 g/ml,37℃孵育1 h;酶标抗体的工作浓度为1∶200,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min;测定各孔A450值.该方法的佳线性范围为50～1 600 ng/ml,低检测为50 ng/ml;不同浓度的Sf9细胞蛋白抗原回收率在87.8％ ～ 117％之间,变异系数均小于10％;制备的3批重组蛋白经超滤及层析纯化后,HCP含量均逐渐降低至小于50 ng/ ml,纯化工艺可有效去除HCP;与商品化试剂盒比较,该方法更适用于检测戊肝类病毒颗粒样品.结论 已成功建立Sf9昆虫细胞残余蛋白含量检测的双抗体夹心法ELSA方法,可用于检测Sf9昆虫细胞/杆状病毒表达系统纯化的重组蛋白中HCP含量.
关键词： Sf9昆虫细胞 宿主蛋白 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 -
抗甲型肝炎病毒卵黄免疫球蛋白的制备及应用
目的 制备抗甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,IgY),并建立双抗体夹心ELISA法,用于测定甲肝疫苗中的HAV抗原含量.方法 用纯化的HAV免疫健康产蛋母鸡,制备抗HAVIgY,采用多步骤分离纯化IgY,紫外分光光度法测定纯化IgY的蛋白含量,还原型SDS-PAGE分析IgY的相对分子质量及纯度,间接ELISA法检测IgY的效价、特异性及其热稳定性和酸碱稳定性.以纯化的IgY作为包被抗体,HRP标记的抗HAV单克隆抗体作为二抗,建立双抗体夹心ELISA法,对疫苗生产过程中的HAV抗原含量进行测定,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较.结果 亲和层析纯化后的抗HAV IgY浓度为3.67 mg/ml;重链和轻链的相对分子质量分别为66 000和27 000,纯度为96.78％;效价高为1∶16000;纯化的抗HAV IgY只与HAV呈阳性反应,与脊髓灰质炎病毒和肠道病毒71 (enterovirus 71,EV71)均不反应;纯化的抗HAV IgY在25～ 70℃条件下处理15 min及经pH 3.0～ 10.0的Tris-HCL缓冲液处理2h,其抗体效价基本无影响.建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.62～2 000.00 ng/ml范围内,HAV浓度的对数值与A450值之间呈线性相关,R2=0.935,低检测量为7.81 ng/ml,与市售试剂盒检测结果具有良好的相关性,相关系数为0.952 7.结论 制备的抗HAV IgY浓度、纯度、效价均较高,特异性较强,稳定性良好,建立的双抗体夹心ELISA法可用于检测甲肝疫苗生产过程中HAV的抗原含量.
关键词： 肝炎病毒 甲型 免疫球蛋白Y 双抗体夹心酶联免疫吸附测定
