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马铃薯Y病毒蚜传辅助成分介导PVX/PVY协生作用
构建了马铃薯Y病毒中国株系(PVY-C)蚜传辅助成分(HC-Pro)基因的正义、反义和缺失三种植物表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草品种NCg9.Southern blot分析表明,HC-Pro基因及其突变体已经整合到烟草染色体中,Western blot分析证明,正义HC-Pro基因及其缺失突变体在转基因烟草中有表达产物.攻毒试验结果证明,转正义HC-Pro基因及其缺失突变体不仅能够提高T1转基因烟草中PVY-C的病毒积累和致病性,而且对异源病毒PVX具有同样的作用,而转反义HC-Pro基因烟草对PVY-C和PVX的致病性无影响.因此PVY-C HC-Pro基因介导PVX/PVY的协生作用.
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CMV抑制PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性
以前曾报道用RNA介导的抗病毒策略,获得了高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVyNCP)的转基因烟草,并对T1、T2代转基因植株进行了遗传和抗病性分析[1].此次以T3代转基因植株为试验材料,在筛选高度抗病植株并证明其抗病性是基于转基因沉默的基础上,采用Northern杂交的方法,证明CMV侵染抑制了转基因植株中PVYNCP基因的沉默,而且CMV对PVYNCP基因沉默的抑制部位是发生在接种后的新生叶上,接种叶及其下部叶片中PVyN CP基因沉默则未受到影响.采用ELISA方法对CMV+PVyN复合接种的转基因植株进行PVyN检测,结果表明,接种叶及下部叶没有检测到PVyN,植株叶片对PVyN表现为抗病.而在CMV接种后植株新生叶中则检测出了高滴度的PVYN,植株叶片对PVYN表现为感病.该文报道了在表达PVYNCP基因的RNA介导抗性转基因植株中,异源病毒侵染抑制了转基因的沉默,并导致转基因植株的抗病性丧失.
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翻译和非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较
利用RT-PCR方法克隆获得马铃薯Y病毒烟草叶脉坏死株系(PVYN)的可翻译和不可翻译外壳蛋白(CP)基因,并分别插入pROKⅡ质粒中获得重组双元表达载体.通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转化方法,将可翻译和不可翻译的PVYN-CP基因分别导入烟草栽培品种NC89叶片组织中,得到抗卡那霉素的再生植株.对所得到的抗卡那霉素的再生苗进行PCR检测表明,被导入可翻译和不可翻译CP基因的植株分别占卡那霉素抗性植株的95%和98%.攻毒实验表明,两种类型的转基因烟草对PVYN的抗病性具有相似性,其表现型为:免疫、抗病和感病.免疫型转基因植株的抗病性不受接种物类型及其剂量的影响.Southern印迹杂交结果显示,目的基因已经整合到烟草基因组中.Northern印迹杂交证明,两种类型的CP基因都已在RNA水平上得到了表达,但细胞内RNA的积累量与转基因植株的抗病强度成负相关.Western印迹杂交表明,在表达不可翻译PVYN-CP基因的转基因植株内未检测到CP蛋白,而在导入可翻译的PVYN-CP基因的植株内检测到了CP蛋白,且CP蛋白含量与抗病性不存在正相关.本研究结果证明,表达可翻译与不可翻译PVYN-CP基因的转基因烟草对PVYN的抗病性均为RNA介导的抗病性.
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马铃薯Y病毒NIb复制酶基因在转录水平介导的相对广谱抗病性
在大肠杆菌中表达了马铃薯Y病毒中国分离物(PVY-C)复制酶NIb基因,并制备了其抗血清.利用PCR定点突变方法使NIb基因移码-1位,构建了移码-1位NIb基因(UN)的植物表达载体.通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)介导转化烟草NC89,获得51株再生植株.对再生植株的分子检测结果表明,转基因烟草中检测到UN基因相应的RNA转录产物,推测该基因已经整合到烟草染色体中.攻毒试验发现转UN基因烟草(T0代)对两个PVY株系和烟草蚀纹病毒的抗病性与转全长、缺失5′端381bpNIb基因烟草(T2代)的相同.Western印迹试验结果表明,在本试验检测水平上,在转基因T2代烟草中未检测到NIb基因的表达产物.实验结果支持PVY-C复制酶NIb基因在转录水平上介导相对广谱抗病性的假说.
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怀山药病毒病的研究
目的探明怀山药病毒病的症状和感染病毒的种类,为脱除怀山药病毒、提高产量、改善品质奠定基础.方法调查怀山药大田感病情况,应用电镜法观察病毒的大小和形状,采用分子生物学方法进一步探明病毒种类.结果怀山药感染病毒后的症状为叶色失绿、花叶、畸形;在透射电镜下,观察到长600～1 200 nm的线状病毒,并初步判断为马铃薯Y病毒PCR扩增后的电泳检测显示出了清晰的马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒的电泳条带.结论首次发现怀山药感染的病毒为马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒,它是造成怀山药产量下降和品质退化的主要原因.
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马铃薯Y病毒p1基因的克隆与序列分析
利用依据马铃薯Y病毒(PVY)pl基因序列设计合成的一对引物YPI,YP2,以带毒烟草总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到了0.83kb的目的条带,测序结果表明为PVY pl基因.通过对PVY P1蛋白氨基酸序列分析发现PVY不同分离物间P1蛋白氨基酸序列存在明显差异,氨基酸序列同源性在64%-94%间.依据Pl蛋白氨基酸序列建立了PVY系统关系树并对PVY进行了类型分析.
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马铃薯Y病毒基因组连接蛋白的原核表达及纯化
设计合成马铃薯Y病毒基因组连接蛋白基因的特异引物，以本实验室获得的AQ4分离物cDNA为模板，通过PCR方法扩增得到目的基因，连入表达载体PEHISEGFPTEV及PEHISTEV，用IPTG诱导，使其在大肠杆菌中得到正确表达，并利用镍柱对VPg蛋白进行纯化，为抗血清的制备以及VPg蛋白晶体结构和互作蛋白的研究奠定基础。
