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石菖蒲-远志药对配伍机制初步探讨
目的:对石菖蒲-远志药对配伍机制进行研究.方法:利用HPLC技术对药对共煎物及单味药水煎物进行了分析.制备了α-细辛醚-细叶远志皂苷结合物,采用红外光谱法(MIR)、差式扫描量热分析(DSC)及粉末X射线衍射(PXRD)对其研究.并对比了α-细辛醚、细叶远志皂苷与结合物的溶解曲线.结果:α-细辛醚和细叶远志皂苷在共煎物中的含量高于单味药水煎物;结合物呈现出与单体成分的显著差异,且在水中的溶解性显著优于单体成分.结论:石菖蒲-远志药对配伍的物质基础机理很可能为α-细辛醚和细叶远志皂苷二者结合,引起理化性质改变,增加了二者的煎出.
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Sybr green 1实时定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的探索
目的寻找一种能广泛用于临床快速、简便、灵敏度和特异性较好、价格低廉的乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量诊断方法.方法以Sybr green 1作为荧光指示剂,做样品血清DNA的实时定量聚合酶链反应(PCR),并结合溶解曲线结果,与Taqman荧光定量方法结果进行了对比.结果 Taq man法较好地检出体内HBV DNA载量.Sybr法测得样品的病毒拷贝数5.3×104 copies/ml与Taqman法所得数值9.6×104 copieslml相近,但检出率偏低.结论 Sybr green 1荧光实时定量方法简便、便宜,但检出率偏低.
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多重耐药微生物的实验室检测新技术
以核酸体外放大为基础,直接检测与微生物耐药有关基因及突变的实验室技术近年来快速崛起.快速、准确的分子生物学检测方法 将在全球的多重耐药微生物防控中起决定性作用.笔者对多重PCR技术结合溶解曲线分析、反向线性杂交技术、基因芯片技术、飞行时间质谱技术及现场即时分子检测技术及其在微生物耐药检测中的应用进行综述.
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“FQ-PCR溶解曲线法”监测麻风患者TCR a链CDR3谱系漂移的研究
麻风病是由麻风杆菌引起的一种慢性接触性传染病。主要侵犯人体皮肤和神经，如果不治疗可引起皮肤、神经等永久性的损害。当下，我国对麻风病的治疗以预防为主，而对于那些已经患上麻风病的患者来说，治疗方法还值得更深层次的研究探索。本篇文章的研究方法是通过T细胞受体a链V区基因各家族CDR3免疫谱系分析技术来监测麻风患者TCR a链CDR3谱系的漂移情况，进而初步分析出TRAV家族的CDR3 PCR产物定量和克隆增生情况，以此为被麻风感染后的患者的T细胞免疫应答变化提供新的研究方向。
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基于探针溶解曲线的致泻性大肠杆菌快速检测的可行性研究报告
肠道传染病仍然是我国主要的疾病负担,发病数和发病率居我国传染病的前五位.引起肠道传染病的病原体主要包括细菌、病毒和寄生虫.致泻性大肠杆菌属于条件性致病菌,是与人类疾病有关的大肠杆菌的统称,其在自然界分布广泛,但主要寄居在人类及动物的肠道内,是引起全球婴幼儿急、慢性腹泻和成人散发腹泻的一类重要病原菌,包括肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli,ETEC)、致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC)、侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive E.coli,EIEC)等[1].
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采用荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCR alpha链CDR3谱系漂移技术的初步探讨
目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCR alpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生).方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCR alpha 链胚系可变区基因家族 (TRAV)设计上游引物,共同的TCR alpha 胚系链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生.结果:正常人外周血T细胞TCR alpha链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的溶解曲线谱型图(melting curve spectratyping)呈现熔点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布,2例淋巴瘤型白血病患者外周血T细胞TCR alpha链32个家族CDR3表达频率不一致,部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的溶解曲线谱型图上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族.结论:荧光定量PCR溶解曲线分析TCR alpha链CDR3谱系漂移技术方法稳定简便,能较好地监测正常人和临床样本外周血T细胞TCR alpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生).
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三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR与ELISA检测弓形虫的比较
目的 选取弓形虫基因组中高度保守的多拷贝基因529 bp重复序列、ITS-1序列和B1基因作为real-timePCR检测的靶基因,建立检测弓形虫的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的检测方法并且与ELISA检测方法进行比较.方法 将529 bp重复序列、B1基因、ITS-1序列的选定扩增序列进行克隆、测序构建标准品;将构建的3个标准品放在一个体系中进行扩增,进行三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR.结果 529 bp、ITS-1和B1的标准曲线的相关系数(R2)均为0.998,并且扩增效率均为96.724%,扩增片段的Tm值分别为 86.5±0.5 ℃ 、78.8±0.5 ℃、83.1±0.5 ℃;构建的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR特异性试验表明,529 bp、ITS-1和B1有特异性的溶解曲线峰值分别是86.2 ℃、78.9 ℃和83.3 ℃,阴性对照无扩增曲线;敏感性试验表明,529 bp、ITS-1和B1序列低检出限分别为 173copies/μL、123copies/μL、和135 copies/μL;Tm值的批内、批间重复试验的变异系数均小于0.13%;ELISA检测猪弓形虫IgG抗体的阳性率41.72%,ELISA与荧光定量PCR检测核酸阳性符合率为53.44%(P＜0.01).结论 建立弓形虫三重SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测技术具有高特异性和敏感性,可为临床弓形虫的诊断提供科学依据
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姜黄素赖氨酸共晶的制备及不同晶型溶解性对比
目的:开发一种姜黄素药物共晶,以改善姜黄素生物利用度低、成药性差的问题.方法:采用溶剂结晶法,制备姜黄素-赖氨酸共晶,并培养得到a、b两种晶型.通过元素分析、差示扫描量热分析、X射线衍射法分别对其进行表征.测定上述两种晶型的溶解曲线,同姜黄素作对比.结果:姜黄素与赖氨酸按照1:1的化学计量比结合,形成共晶,得到的共晶溶解性能明显优于姜黄素.结论:姜黄素-赖氨酸共晶具有良好的成药性可作为新的化学实体进行后续开发.
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荧光定量PCR溶解曲线监测HIV感染者TCR α、β链CDR3谱系漂移技术的建立
目的 建立荧光定量PCR(FQ-PCR)溶解曲线分析技术监测人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者外周血T细胞受体(TCR)α、β链 CDR3 谱系漂移.方法 提取HIV感染者外周血单个核细胞中的总RNA,逆转录成cDNA,设计人32个TCRAV、26个TCRBV基因家族上、下游引物,FQ-PCR扩增HIV感染者TCRAV和TCRBV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的寡克隆增生,并与传统的CDR3检测技术基因扫描检测结果比较分析.结果 FQ-PCR溶解曲线分析技术与基因扫描检测结果一致,HIV感染者TCR α链和β 链家族CDR3表达频率不一致,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但出现数量不等的寡克隆增生家族.结论 FQ-PCR溶解曲线法监测HIV感染者TCR α、β链CDR3谱系漂移技术操作简单,检测成本低,可以用来监测HIV感染者外周血T细胞TCR α、β链CDR3 谱系漂移.
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"荧光定量PCR溶解曲线法"监测人TCR β链CDR3谱系漂移技术的建立
目的 建立"荧光定量PCR溶解曲线分析技术"监测人外周血T细胞TCR β链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生).方法 提取4例正常人、9例大肠癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell-PBMC)中的总RNA,逆转录成cDNA,以26个人TRBV基因家族设计上游引物,共同的TRBC基因设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增26个TRBV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生.结果 正常人外周血T细胞TCR β链26个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"(melting curve spectratyping)呈现溶点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布;9例大肠癌患者的外周血TCR β链CDR3谱系的26个家族CDR3表达频率不一致,有的患者部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族.结论 "荧光定量PCR溶解曲线分析TCR CDR3谱系漂移技术",方法稳定简便,能较好的监测正常人和临床样本外周血T细胞TCR β链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生).
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多系统萎缩患者TCR α链CDR3谱系的荧光定量PCR溶解曲线
目的:利用荧光定量PCR溶解曲线分析技术检测1例多系统萎缩患者TCR α链CDR3谱系.方法:提取1例多系统萎缩患者和1例正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCR α链胚系可变区基因家族 (TRAV)设计上游引物,共同的TCR α链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单、寡、多克隆增生,挑选单克隆进行PCR扩增,扩增产物行普通琼脂糖凝胶回收后测序分析.结果:多系统萎缩患者和正常人PBMC的32个TCR α链TRAV家族CDR3谱型的FQ-PCR产物的各家族相对定量表达不一;正常人的32个TCR α链TRAV家族CDR3谱型的溶解曲线图表现为多个峰型的高斯分布,多系统萎缩患者的TRAV10、TRAV15、TRAV29家族CDR3谱型的溶解曲线表现为单峰的克隆性增生,其他家族为多峰、寡峰的多克隆及寡克隆增生,未出现缺失的家族,对单峰的TRAV15家族的测序得到的CDR3区的氨基酸组成为:SAIYFCAEDRDSTLTFG.结论:该多系统萎缩患者的PMBC中,存在TCR α链CDR3谱系漂移.
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FQ-PCR溶解曲线技术初步分析HFRS患者PBMC中T细胞TCR α链CDR3谱系特征
目的 采用FQ-PCR溶解曲线技术初步分析肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)患者外周血T细胞TCR α链各可变区基因家族(TRAV) CDR3谱系特征.方法 提取4例健康志愿者和15例HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC)的总RNA,逆转录成cDNA,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增34条TRAV基因家族CDR3受体库,采用溶解曲线技术分析CDR3谱系特征,并测序分析部分单克隆家族CDR3区基因和氨基酸序列的组成和特征.结果 健康志愿者外周血T细胞TCR α链34个TRAV家族CDR3的溶解曲线谱型图呈现CDR3多克隆增生的高斯分布;15例HFRS患者多数TRAV家族CDR3的溶解曲线谱型图为多克隆增生的高斯分布,但出现数量不等的单克隆、寡克隆、极低水平表达的TRAV家族.部分测序结果显示TCRα链优势取用TRAV家族的CDR3区有着不同的基因序列和氨基酸组成.结论 HFRS患者外周血中TCR α链各TRAV家族CDR3溶解曲线谱型图出现数量不等,形态不一的单峰、寡峰/偏峰、极低水平的现象,表现出不同的异常频率,TRAV优势取用家族的CDR3区有着不同的基因序列和氨基酸组成,实验结果可为进一步研究HFRS个体特异性T细胞应答提供基础.
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FQ-PCR溶解曲线技术分析白血病患者PBMC中T细胞TCRα/βCDR3谱系特征
目的 采用FQ-PCR溶解曲线技术分析临床白血病患者外周血单个核细胞(PBMC)中T细胞TRAV和TRBV基因各家族的CDR3谱系特征.方法 提取4例健康志愿者和15例临床白血病患者PBMC中mRNA,逆转录成cDNA,FQ-PCR扩增32个TRAV基因和24个TRBV基因家族的CDR3区,FQ-PCR溶解曲线技术分析CDR3谱系特征,并测序分析单克隆家族CDR3区氨基酸序列的组成.结果 4例健康志愿者PBMC中α/βT细胞的CDR3谱系FQ-PCR溶解曲线峰型图,均表现为多峰图;而15例白血病患者PBMC中α/βT细胞CDR3谱系FQ-PCR溶解曲线峰型图,多数患者出现寡或偏峰型图、低或无峰型图、典型的单峰型图;不同白血病患者异常峰的频率不一致;单峰型图TRAV和TRBV PCR产物基因测序,未发现不同患者存在完全相同的CDR3区.结论 FQ-PCR溶解曲线技术能很好的分析白血病患者PBMC中TCR α/β CDR3谱系的单、寡、多克隆性增殖;非T细胞白血病患者PBMC中TCRα/β CDR3的单峰(或寡峰)家族T细胞,可能来源于机体对肿瘤应答的T细胞,而在T细胞白血病患者,可能为肿瘤T细胞或机体抗肿瘤T细胞.本实验可为进一步研究白血病的免疫应答机制和个体化治疗提供基础.
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荧光定量PCR溶解曲线分析技术检测多系统萎缩患者TCRβ链CDR3谱序初探
目的 利用荧光定量PCR溶解曲线分析技术检测多系统萎缩病人TCRβ链CDR3谱序.方法 提取1例多系统萎缩病人外周血单个核细胞中的总RNA逆转录成cDNA,以26个人TRBV基因家族设计上游引物,共同的TRBC基因设计下游引物,用荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增26个TRBV基因各家族CDR3谱系,根据其溶解曲线图分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生.结果 该病例外周血T细胞TCRβ链26个家族CDK3表达频率不一致,有的家族呈现缺失状态,有的家族出现寡克隆状态.结论 该多系统萎缩病人TCRβ链CDR3存在谱系漂移,有的表达呈寡克隆,有的无表达呈缺失.
