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荧光双重标记Cx43在大鼠"足三里"表达的实验研究
目的:研究缝隙连接蛋白Cx43在大鼠"足三里"穴的表达及其与穴位、经络的可能关系. 方法:20只健康成年SD大鼠随机分为非针刺组、针刺组,每组10只.应用荧光双重标记免疫组织化学方法和激光扫描共聚焦显微镜技术对成年大鼠皮肤肌肉组织的Cx43进行定位、定量分析. 结果:皮肤肌肉组织中Cx43主要在表皮上皮细胞、皮下筋膜的肥大细胞中表达;非针刺组中穴位处 Cx43的表达显著高于非经非穴处,两者相比有极显著性差异(P<0.01);穴位针刺后Cx43表达显著增加,与非针刺组中穴位比较有极显著性差异(P<0.01). 结论:电针可使"足三里"穴区皮肤及肌肉组织中的Cx43表达明显增加,缝隙连接蛋白及缝隙连接可能在经络活动中起重要作用.
关键词： 经穴 缝隙连接蛋白Cx43 电针 荧光双重标记 -
针刺对大鼠不同部位穴位Cx43表达的影响
目的:观察针刺大鼠穴位和非穴位对细胞缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响,探讨穴位的相对特异性.方法:将20只Wistar大鼠随机分为2组,一组为针刺组,另一组为空白对照组,每组10只.对照组大鼠不做任何干预直接用空气栓塞法处死；针刺组大鼠选上肢“内关”穴,下肢“后三里”即“足三里”穴,背部“大椎”穴和腹部“关元”穴,对以上穴位、穴位旁1 cm处及爪部“涌泉”穴,行手针针刺,留针30 min后,空气栓塞处死.固定后,取两组大鼠穴位处及穴位旁开1 cm处的组织块,涌泉穴只取穴位处,冰冻切片.采用Cx43的免疫组化染色方法染色.结果:两组大鼠各穴位处Cx43的表达均显著高于其穴位旁(均P＜0.01)；针刺组穴位处Cx43的表达均显著高于对照组穴位处(均P＜0.01).结论:穴位和非穴位之间Cx43的表达有显著性差异,表明穴位确实存在且有其相对特异性.
关键词： 穴位 特异性 针刺 免疫组织化学法 缝隙连接蛋白Cx43 -
大气细颗粒物对心肌细胞缝隙连接通讯的影响
目的 探讨大气细颗粒物(PM2.5)对原代培养大鼠心肌细胞的急性毒性作用及对缝隙连接通讯的影响.方法 对出生24 h的SPF级SD大鼠乳鼠分离心肌细胞进行原代培养,以不同浓度(0、1、10、100g/μml)的PM2.5染毒24 h,采用划痕染料标记示踪法(SLID)测定细胞缝隙连接通讯(GJIC)水平,采用间接免疫荧光细胞化学方法测定缝隙连接蛋白Cx43分布及密度,采用免疫印迹法测定连接蛋白Cx43的表达.结果 随PM2.5浓度的上升,细胞间荧光扩散面积减少,细胞膜连接处Cx43绿色荧光减弱,Cx43蛋白表达量稍有减少.与对照组比较,10和100μg/ml染毒组细胞间荧光扩散面积减少,差异有统计学意义(P<0.01);10和100 μg/ml染毒组Cx43荧光强度下降,差异有统计学意义(P<0.01).结论 PM2.5可抑制心肌细胞的缝隙连接通讯功能.其机制可能是通过影响心肌细胞的Cx43表达和分布.
关键词： 空气污染 颗粒物 心肌细胞 缝隙连接通讯 缝隙连接蛋白Cx43 -
漆黄素通过缝隙连接影响顺铂细胞毒性
目的：体外观察漆黄素对顺铂细胞毒性作用影响及其机制。方法 CCK-8法观察不同浓度漆黄素对人胶质瘤U87细胞的毒性；用细胞接种荧光示踪法测定不同浓度漆黄素对U87细胞缝隙连接( GJ )功能的影响；标准细胞集落形成分析法观察顺铂的毒性及漆黄素对顺铂毒性的影响；用Western blot法研究漆黄素在影响GJIC( GJ intercellular com-munication)功能浓度范围内对 Cx43表达的影响。结果CCK-8法显示漆黄素在小于1μmol·L-1的浓度范围内无细胞毒性；细胞接种荧光示踪法显示漆黄素浓度越高, U87细胞GJ通讯的荧光传递功能越强；标准细胞集落形成分析法显示,20μmol·L-1顺铂能够抑制U87细胞的集落形成,而且在有GJ形成的细胞顺铂对细胞集落形成的抑制作用显著高于无GJ形成的细胞；Western blot结果显示漆黄素对Cx43蛋白表达量无明显影响。结论漆黄素可以增强顺铂的细胞毒性,该作用可能与漆黄素增强U87细胞的GJ通讯功能有关,与Cx43蛋白表达水平变化无关。
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缝隙连接蛋白Cx43介导硫化氢后处理对大鼠心肌的保护作用
目的 探讨缝隙连接蛋白Cx43是否参与硫化氢后处理减轻离体大鼠心脏缺血/再灌注(I/R)损伤.方法 72只♂SD大鼠随机分为6组(n=12):空白组(Sham组),缺血/再灌注组 (I/R组),溶媒组 (DMSO 组),抑制剂18β-次甘草酸组(AGA组),硫化氢后处理组 (NP 组),硫化氢后处理+AGA组 (N+A组).采用离体心脏 Langendorff灌注模型,平衡灌注 20 min后,停灌 30 min,复灌 60 min.记录平衡末及灌注结束时的心率 (HR)、左室舒张末期压 (LVEDP)、左室发展压 (LVDP)、左室内压上升大速率(+dp/dtmax)、左室内压下降大速率(-dp/dtmax);灌注结束时,TTC染色法检测心肌梗死面积;Western blot半定量线粒体和胞质总的Cx43(total connexin 43,tCx43)和磷酸化Cx43(phosphorylated connexin 43,pCx43)表达水平.结果 平衡灌注末各组间心功能指标差异无统计学意义.再灌注后,与I/R组比较,NP组明显改善再灌注损伤心功能的各项指标(P<0.05),减少心肌梗死面积[(24.4±4.8)% vs (49.4±4.2)%,P<0.05];tCx43表达在线粒体中明显升高,胞质中明显降低,pCx43表达线粒体中明显升高,胞质中明显降低.AGA逆转了硫化氢后处理产生的心肌保护效应及 tCx43和pCx43在线粒体中表达的增加(P<0.05).结论 缝隙连接蛋白Cx43参与了硫化氢后处理减轻离体大鼠心脏 I/R损伤过程.
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siRNA沉默平滑肌细胞Cx43的表达及对细胞增殖的影响
目的 通过siRNA介导的RNA干扰技术沉默平滑肌细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达,观察其对平滑肌细胞增殖的影响.方法 应用阳离子脂质体转染的方法,将化学合成的特异性378siRNA转染平滑肌细胞设为特异性siRNA组,并以转染非特异性siRNA和空白作为对照,半定量RT-PCR法分析转染不同时间(24、48、72、96h)细胞Cx43 mRNA表达水平的变化;同时噻唑蓝(MTT)比色法检测平滑肌细胞增殖,观察转染不同浓度(50、100、150、200nmol/L)378siRNA对细胞增殖的影响.结果 半定量RT-PCR结果显示与非特异性siRNA组及空白对照组相比,转染特异性378siRNA后Cx43 mRNA表达水平显著地下调并呈时间依赖性特点.MTT结果显示与空白对照组相比,转染低浓度(50nmol/L)378siRNA早期(24、48h)OD值开始降低,但差异无统计学意义(P＞0.05),随着特异性siRNA 浓度的升高,OD值显著降低(P＜0.05).200nmol/L 378siRNA转染72、96h对细胞的增殖抑制率分别为32.51%、42.67%(P＜0.01),并呈浓度依赖性特点;而作为阴性对照的siRNA转染后则无上述作用.结论 转染特异性378siRNA可有效沉默平滑肌细胞缝隙连接Cx43mRNA 的表达并抑制平滑肌细胞的增殖.
关键词： 缝隙连接蛋白Cx43 RNA干扰 平滑肌细胞 增殖 -
电针足三里穴促胃动力机制研究
目的 探讨电针足三里穴促胃动力作用机制.方法 采用电生理学方法同步观察电针不同穴位后胃电的变化;采用免疫组化荧光双重标记胃电起搏区Cajal间质细胞(interstitial cells of cajal, ICCs)与缝隙连接蛋白43(CX43)、ICCs 与ERK的方法,观察针刺足三里穴引起胃电起搏区ICCs的变化、与ICCs信息传递相关的CX43的变化、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的ERK的变化情况.结果 电针足三里穴对胃电有明显影响.电针足三里穴可使胃电频率及波幅增高;电针足三里穴可显著激活胃ICCs表达及与ICCs信息传递密切相关的CX43的表达;电针足三里穴能促进胃ICCs调节胃运动的细胞信号转导的MAPK途径中ERK的表达.结论 电针足三里穴对大鼠胃电具有明显的促进作用;电针足三里穴促进胃运动的机制可能通过激活ICCs而产生显著电生理活动,通过ICCs及SMC之间的缝隙连接蛋白传递达到平滑肌进而调节胃运动.这一作用的完成,可能是通过ICCs信号转导MAPK途径中ERK通路实现的.
关键词： 电针 穴位 缝隙连接蛋白Cx43 丝裂原活化蛋白激酶 -
大鼠心肌急性缺氧时缝隙连接蛋白43磷酸化水平的改变及心律失常肽10对其影响
目的:研究急性缺氧时缝隙连接蛋白Cx43磷酸化水平的改变及抗心律失常肽(AAP)10对其影响.方法:大鼠体外心脏灌流模型,随机分为对照组、缺氧30 min组、AAP10干预组,每组各9只.用Western-Blot技术检测Cx43磷酸化水平的改变,用免疫荧光双标结合激光扫描共聚焦成像技术显示Cx43分布的改变.结果:Western-Blot结果显示:缺氧30 min组总Cx43蛋白表达下降(P＜0.05),而去磷酸化的Cx43(NP-Cx43)蛋白表达不变.AAP10干预组能提高总Cx43蛋白表达(P＜0.05),但对NP-Cx43蛋白表达无影响.而免疫荧光结果显示:缺氧30 min组总Cx43和NP-Cx43蛋白分布均明显减少,且AAP10干预组仅能提高总Cx43蛋白表达,但对NP-Cx43蛋白无影响.结论:急性缺氧时细胞间通讯功能下降主要由于磷酸化的Cx43蛋白水平下降,而其中NP-Cx43蛋白的内化也可能参与该影响因素.而AAP10改善传导主要通过促进Cx43磷酸化而发挥作用.
关键词： 心肌缺血 缝隙连接蛋白Cx43 磷酸化 抗心律失常肽 -
脑血管痉挛中缝隙连接蛋白Cx43磷酸化位点分析及S368位点与其关系的研究
目的 观察脑血管痉挛中缝隙连接蛋白Cx43的磷酸化位点及其S368位点磷酸化水平的变化,探讨其与脑血管痉挛的关系. 方法 新西兰大白兔78只按随机数字表法分为4组:正常对照组(n=6)、单纯脑池注血组(n=24)、甘珀酸(CBX)脑池处理组(n=24)和溶媒脑池处理组(n=24),后3组应用枕大池二次注血法建立兔蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛模型及相应给药,并按1d、3d、7d、14d分成4亚组,每亚组6只.采用磷酸化蛋白富集试剂盒富集各组基底动脉中Cx43磷酸化总蛋白,再利用质谱技术鉴定出其磷酸化位点；应用Western blotting方法分析各组Cx43S368位点磷酸化水平的变化；通过数字减影血管造影技术(DSA)观察各组基底动脉直径变化情况. 结果 (1)质谱技术成功鉴定出Cx43的4个磷酸化位点,分别为Y265、S364、S365、S368.(2)Western blotting结果显示:正常对照组基底动脉Cx43 S368位点磷酸化水平较低(17.0％±2.3％)；单纯脑池注血组及溶媒脑池处理组与正常对照组相比,Cx43 S368位点磷酸化水平在1d、3d、7d、14d各时间点均显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05),且以7d表达高,14d开始下降；CBX脑池处理组各时间点基底动脉Cx43 S368位点磷酸化水平显著低于单纯脑池注血组及溶媒脑池处理组,差异有统计学意义(P＜0.05).(3)DSA显示正常对照组第二次与首次造影基底动脉直径的百分比值平均为99.1％±1.3％,单纯脑池注血组、CBX脑池处理组、溶媒脑池处理组分别为66.1％±7.2％、91.3％±5.3％、63.7％±6.6％,CBX脑池处理组基底动脉直径显著狭窄于单纯脑池注血组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 缝隙连接蛋白Cx43 S368位点磷酸化可能与脑血管痉挛密切相关,且其可能是CBX缓解脑血管痉挛的机制之一.
关键词： 缝隙连接蛋白Cx43 磷酸化 脑血管痉挛 -
上调Cx43对心肌细胞间通讯及离子通道的影响
目的 通过重组腺病毒介导缝隙连接蛋白Cx43在体外培养的心肌细胞中过度表达,观察心肌细胞间通讯及细胞离子通道变化.方法 通过RT-PCR法克隆SD大鼠缝隙连接蛋白Cx43基因的全长cDNA,用基因重组的方法构建腺病毒pAdEasy-1-Cx43.行心肌细胞基因转染后,分别用RT-PCR和蛋白质免疫印迹技术检测Cx43在心肌细胞中的mRNA和蛋白表达,用免疫荧光技术分析Cx43在心肌细胞膜上的分布.采用划痕标记荧光染料示踪(SLDT)技术观察培养心肌细胞群之间的罗氏黄(lucifer yellow,LY)染色传输,检测上调Cx43对心肌细胞间通讯的影响;采用单细胞膜片钳技术分析各离子通道电流的变化,观察上调Cx43对心肌细胞膜离子通道表达的影响.结果 腺病毒重组质粒pAdEasy-1-Cx43构建成功;转染心肌细胞后,pAdEasy-1-CX43转染组Cx43 mRNA及蛋白表达上调,且心肌细胞膜上分布较多;细胞划痕荧光染料示踪提示转染后,心肌细胞间通讯增强;膜片钳全细胞膜电流提示转染后钙内流降低,钾离子电流未发现有明显改变.结论 成功构建腺病毒重组质粒pAdEasy-1-Cx43载体,隙连接蛋白Cx43表达上调增强了心肌细胞间通讯以及钙内流,为Cx43改善心室肌电重构,减少或预防室性心律失常发生的进一步研究打下了基础.
关键词： 重组腺病毒转染 缝隙连接蛋白Cx43 细胞划痕荧光染料示踪 细胞间通讯 膜片钳 -
CX43蛋白在低温联合右美托咪啶增加心室复极不均一性中的作用的研究
目的 探讨CX43蛋白在低温联合右美托咪啶处理影响心室复极不均一性中的作用.方法 成年家兔18只,体质量2.0～2.5 kg,制备Langendorff离体心脏灌注模型,取模型制备成功的心脏18个,采用随机数字表法分为3组(n=6):正常对照组(C组)、低温组(H组)、低温+右美托咪定组(HD组).C组继续灌注37℃K-H液60 min,H组灌注32℃K-H液60 min,HD组灌注32℃含右美托咪啶25 ng/mL K-H液60 min.于平衡灌注末(T0)、灌注K-H液15 min(T1)、30 min (T2)和60min(T3)时记录3层心肌单相动作电位,测量单相动作电位复极90％时程(MAPD90),计算跨室壁复极离散度(TDR),记录完毕后取左心室前壁心肌组织进行western blot检测CX43蛋白表达.结果 与C组比较,H组和HD组MAPD90延长,TDR增大,CX43蛋白表达下降;H组与HD组相比较各 项指标,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 CX43蛋白的表达下降可能是低温造成心室复极不均一性增大的原因,而右美托咪啶既不影响CX43蛋白表达,也不加重低温对TDR的影响.
关键词： 缝隙连接蛋白Cx43 低温 右美托咪啶 跨室壁复极离散度 -
波生坦对慢性低氧性肺动脉高压大鼠右心室肥厚及缝隙连接蛋白(Cx)43表达的影响
目的:研究波牛坦(bosentan,BST)对慢性低压低氧性肺动脉高压(HPH)大鼠右心室肥厚及缝隙连接蛋白43(Cx43)表达量的影响.方法:将24只实验动物随机分为正常组、HPH组、安慰剂组和BST治疗组,每组各6只.正常组:常压常氧下饲养6周;其他3组大鼠置于低压低氧仓内8 h/d,共6周,从第4周开始,每天给BST治疗组大鼠BST(100 mg/kg)灌胃,安慰剂组生理盐水灌胃.6周后,所有大鼠测定血流动力学指标:如平均肺动脉压力(mPAP)、右心室收缩压(RVSP)、右心室收缩压上升大速率(dp/dtmax),以及右心室肥厚度[如右心室质量/(左心室质量+室间隔质量),RV/(LV+S)]和右心室质量/体质量(RW/BW).收集动脉血检测血浆内皮素-1(ET-1)和一氧化氮(NO)水平.Masson染色观察心肌胶原纤维容积百分比的变化,免疫组化染色法和Western blot观察Cx43的变化.结果:BST治疗组大鼠的mPAP、RVSP、RV/(LV+S)、RW/BW及心肌胶原纤维容积百分比均较HPH组显著降低(P<0.05),但血浆NO、ET-1的水平和心肌Cx43表达量显著升高(P<0.05).结论:BST在降低肺动脉压力的同时,还可抑制右心室肥厚和Cx43表达量的降低.
关键词： 低氧性肺动脉高压 渡生坦 心肌肥厚 缝隙连接蛋白Cx43 大鼠
