RT-PCR法检测地龙及地龙溶栓胶囊中口蹄疫病毒

目的：用RT-PCR法检测地龙及其制剂溶栓胶囊中是否存有口蹄疫病毒。方法：提取样品总RNA，用一步法RT-PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，以电泳图中待测样品扩增产物是否出现与阳性对照相同的条带来判断样品是否为阳性。结果：电泳结果显示，不同效期3批溶栓胶囊和地龙冻干粉原料口蹄疫病毒检测结果均为阴性，提示其不含有口蹄疫病毒。结论：该法简便、快捷，具较高的特异性和灵敏性，可以为中药材及制剂中病毒的检测提供参考。

口蹄疫的诊治进展

口蹄疫(FMD)俗称"口疮"、"蹄黄"等.它是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的偶蹄动物的一种急性、发热性、高度接触性传染的疾病,也是一种人畜共患病.易感染FMD的偶蹄动物约有70多种,常见的动物有牛、羊及猪等.由于发病动物在口腔和蹄部的病变和症状明显,所以称为FMD.FMD感染率高、传播速度快、危害大,因此被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物传染病之首[1].FMD可引起幼畜死亡、产奶量下降、肉食减少、肉品质下降,动物的生产性能降低.此外,由于贸易的限制和禁止动物及其产品的出口而引致的损失更大.FMD的暴发已经影响到国际关系、国家声誉和经济发展,在国际上素有"政治经济病"之称.

抗病毒多肽疫苗临床研究现状

自20世纪80年代Strohmaier等[1]人发现口蹄疫病毒(FMDV)的146～154及200～213氨基酸肽段含免疫学位点,从而找到了一种新型疫苗,即肽疫苗.

口蹄疫病原免疫学的分子基础

FMDV属于微RNA病毒科,口蹄疫病毒属成员,是一种单股正链RNA病毒.基因组长度约为8 500 nt, 5'端共价连接一种特殊的小蛋白VPg(3B),其后为一个约1 300 nt的5'非编码区,与宿主RNA相比,FMDV的5'非编码区没有帽子结构,而是靠一个内部核糖体进入位点(IRES)启动基因组的复制;3'端含有poly(A)的尾巴,尾巴上游为100 nt的非编码区.5'非编码区和3'编码区之间为一个大约7 500 nt 的开放阅读框(ORF),编码一个2 300 aa多聚蛋白,这个多聚蛋白在感染细胞中或体外翻译体系从未发现,因为其被病毒编码的蛋白酶迅速裂解,这个蛋白酶也存在于多聚蛋白中.

负载口蹄疫病毒VP1蛋白质的树突状细胞对T细胞产生IFN-γ的影响

目的:研究负载口蹄疫病毒VP1蛋白质的树突状细胞对淋巴结T细胞产生IFN-γ的影响.方法:构建pET32a-VP1原核表达载体,经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白VP1.制备骨髓源树突状细胞(BMDC)和淋巴结T细胞,将纯化的VP1蛋白质负载BMDC后与淋巴结T细胞共培养,收集不同时间点的共培养上清液,用ELISA检测其IFN-γ的含量.结果:本实验成功构建了pET32a-VP1原核表达载体,并获得了VP1蛋白质.在负载VP1蛋白质的BMDC与T细胞共培养后,实验组各时间点上清液的IFN-γ含量均高于对照组(3小时除外),特别是在共培养后9、24和48小时,差异显著.结论:负载FMDV VP1蛋白质的BMDC可有效激活淋巴结T细胞,从而启动Th1细胞免疫应答,分泌大量IFN-γ.

建立一种用重组蛋白检测抗口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法

目的:研究以重组蛋白作为包被抗原检测口蹄疫病毒(FMDV)感染后的动物血清中特异性抗体的可能性,为建立一种非病毒颗粒的ELISA检测试剂盒提供实验依据.方法:利用自行构建表达的O型口蹄疫病毒VP1表位肽重组蛋白(VP1epi)作为包被抗原,采用间接ELISA方法确定抗原的佳工作浓度和包被方法,优化各项实验条件,并以FMDV感染后的豚鼠血清作为标准阳性血清确定ELISA方法的特异性和灵敏度.结果:FMDV感染后的阳性豚鼠血清可以很好地识别VP1epi重组蛋白,用此蛋白包被检测抗FMDV抗体的灵敏度可达1∶3 200,并证明所检测的抗体是FMDV特异性的.结论:VP1epi重组蛋白可以替代FMDV颗粒用于建立检测抗FMDV抗体的ELISA试剂盒.

负载灭活口蹄疫病毒树突状细胞对CD8+T细胞的旁位活化效应

目的:探讨在体外条件下负载灭活口蹄疫病毒(FMDV)树突状细胞活化CD8+T细胞的机制.方法:用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白介素-4(rmIL-4) 将小鼠外周血单核细胞诱导分化成树突状细胞(MoDCs),以信号阻断法从淋巴结T细胞制备CD8+T细胞,利用负载灭活FMDV的MoDCs与CD8+T细胞共培养,以FMDV+MoDCs+淋巴结T细胞作为对照,用ELISA检测不同时间培养上清液中IFN-γ的含量.用蛋白酶体抑制剂和溶酶体抑制剂处理MoDCs,2小时后再负载灭活FMDV,并与CD8+T细胞共培养,对照组则用FMDV+MoDCs+CD8+T细胞和FMDV+MoDCs,用ELISA检测不同时间培养上清液中IFN-γ的含量.结果:在共培养9小时,CD8+T细胞的IFN-γ释放量约为淋巴结T细胞IFN-γ释放量的1/6,随后,淋巴结T细胞和CD8+T细胞均产生少量IFN-γ.用灭活FMDV负载被lactacystin和氯喹处理的DCs与CD8+ T细胞共培养后9～12小时,CD8+T细胞产生IFN-γ显著减少,在共培养24小时,IFN-γ释放显著增多,并在36小时达到峰值,与对照组相比,差异有统计学意义.结论:负载灭活FMDV的MoDCs可以活化淋巴结T细胞,而且,还可通过非MHCⅠ和非MHCⅡ类分子依赖途径激活CD8+T细胞,此即旁位活化效应.

口蹄疫病毒2B基因绿色荧光蛋白融合表达质粒的构建及表达

目的 构建口蹄疫病毒(FMDV)2B基因绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达.方法 RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒WFL株的2B基因,克隆入表达载体pEGFP-C1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定.将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和2B基因转录水平.结果 经双酶切及PCR鉴定,目的 基因片段大小与预期相符,测序结果与WFL株相应序列一致.荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有2B基因的转录.结论 已成功构建了FMDV 2B基因GFP融合表达质粒,并在BHK一21细胞中获得了表达.

口蹄疫病毒WFL株2C-P3-3'NCR片段的克隆及适于设计siRNA的序列分析

目的 筛选出口蹄疫病毒(FMDV)基因组上适于设计siRNA的基因片段.方法 以FMDV WFL株RNA为模板,用3'RACE法扩增出2C-P3-3'NCR序列,将PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,进行序列测定,并与参考毒株序列比较.结果 扩增的基因片段大小为4 033 bp,其2C、P3和3'NCR序列的核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为87.11%～94.23%、84.91%～96.66%和66.98%～82.35%,2C和P3与参考毒株的氨基酸同源性分别为94.97%～99.39%和91.84%～98.55%,WFL株P3基因的第1 150～1 270、1 680～1 840和2 080～2 490 bp以及2C基因的第354～470 bp范围内与参考毒株具有高度保守的特性.因此,可以依据siRNA设计原则,在这4个区域内筛选抑制效果好的siRNA.结论 成功克隆了FMDV WFL株2C-P3-3'NCR基因的序列,并筛选出4个适于设计siRNA的基因区段.

C型口蹄疫病毒VP1基因的串联与原核表达

目的构建C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,并鉴定其表达产物的免疫反应性.方法首先合成C型口蹄疫病毒C-S8C1株VP1基因的3个抗原表位,并克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点酶切后连接,构建出C型VP1双拷贝基因片段(VP1C).将VP1C基因连接到原核表达载体pET-CKS上,构建重组质粒pETCKS-VP1C,转入BL21菌中进行原核表达.采用SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物,并利用包涵体洗涤法对表达产物进行初步纯化.结果VP1C基因在大肠杆菌中获得表达,产量占沉淀蛋白的45%,且表达产物可以被C型口蹄疫病毒标准血清所识别.VP1C重组蛋白纯度达84.1%.结论已成功构建了C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,所表达的VP1C有良好的免疫反应性,可以作为检测C型口蹄疫病毒的候选基因.

共表达口蹄疫病毒O型P1-2A-IL-18基因和Asia Ⅰ型P1-2A-3C基因重组鸡痘病毒的构建

目的 构建共表达口蹄疫病毒(FWDV)O型P1-2A-IL-18基因和Asia Ⅰ型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒.方法 将酶切得到的FWDV O型P1-2A-IL-18基因和Asia I型P1-2A-3C基因克隆至鸡痘病毒表达载体pUTAL上,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18,与鸡痘病毒(FPV)282 E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU 3次加压筛选.挑选出单克隆重组病毒株,进行RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)鉴定.结果 重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18经双酶切鉴定证明构建正确.经RT-PCR和IFA鉴定,证明所筛选的重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C-P1-2A-IL-18基因盒.结论 已成功构建了共表达FMDV O型P1-2A-IL-18基因和Asia Ⅰ型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒.

口蹄疫病毒复合多表位DNA疫苗的设计及构建

目的 构建口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT及其DNA疫苗.方法 以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和Asia1型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,非结构蛋白3ABC上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白VP4上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建表达盒.将构建好的表达盒OAAT克隆到真核表达载体pVAX1 PCMV启动子下游,构建三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT,并用Western blot和IFA方法检测目的蛋白在HeLa细胞中的表达.结果 通过InsightⅡ软件同源建模和DNAStar 5.0软件分析表明,所构建的FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT理论上符合设计要求,且在真核细胞获得了正确表达.结论 已成功设计FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT,并构建了三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT.

Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A-3C基因真核表达质粒.方法 采集疫区牛的水疱液及水疱皮,经RT-PCR法扩增出Asia 1型FMDV的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切、连接,获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C.经酶切获得P1-2A-3C片段,插入真核表达载体pVAXⅠ pCMV启动子下游,构建pVAXI-P1-2A-3C真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,进行IFA检测.结果 Asia 1型FMDV真核表达载体pVAXⅠP 1-2A-3C,经酶切鉴定证明构建正确,转染HeLa细胞后,可见明显的黄绿色荧光,表明P1-2A-3C基因得到了表达.结论 pVAX Ⅰ-P1-2A-3C可作为Asia 1型FMD核酸疫苗的候选疫苗.

口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因的克隆及序列分析

目的对口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因进行PCR扩增、克隆和序列分析,了解FMDV基因型与血清型的相关性及分子免疫机理,便于疫苗株的选择.方法应用RT-PCR方法扩增了CC-1毒株的衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因,并将其克隆到pGEM-T easy载体上,分别构建含有P1基因和3C基因的两个重组质粒pGEMP1和pGEM3C,并进行核苷酸序列分析.结果 CC-1株与相同血清型毒株P1基因核苷酸序列和氨基酸序列存在较高的同源性,与不同血清型毒株P1基因氨基酸序列的同源性差异显著,而不同血清型毒株的蛋白酶3C基因氨基酸序列的同源性均在90%以上.结论成功地克隆了FMDV P1区基因和蛋白酶3C基因,为选择口蹄疫病毒疫苗株提供了背景材料.

口蹄疫新型疫苗的研究进展

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物一种急性、高度接触性传染病.本病传播迅速,感染率高.近几年,FMD在亚洲国家及英、法等欧洲国家(包括一些原来宣布无口蹄疫国家)相继发生,给发病国家和地区的经济造成重大的损失.

国内不同基因型Asial型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法的建立

目的 建立口蹄疫病毒(FMDV)Asial型江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法.方法 在比较大量国内外FMDV流行毒株序列的基础上,设计检测不同基因型Asial型FMDV江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联PCR引物,优化单项和二联RT-PCR反应条件.并进行特异性及相关病毒检测.结果 优化的单项和二联RT-PCR特异性均良好.检测9份FMDV,病料的结果与其基因序列测定结果完全一致.结论 已建立了FMDV Asial型江苏/05谱系和新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法,为FMDV的诊断、流行病学调查及疫苗应用奠定了基础.

口蹄疫病毒VP1、VP4基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性

目的 构建口蹄疫病毒(FMDV)VP1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性.方法 通过RT-PCR获得FMDV VP1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建VP1单表达以及VP1、VP4融合表达和共表达质粒.转染BHK-21细胞后,Westem blot检测目的蛋白的表达.将上述3种基因核酸疫苗、VP1单表达与VP4单表达联合疫苗、灭活疫苗和空载体对照免疫豚鼠,检测血清特异性抗体及中和抗体水平,并进行保护力试验.结果 VP1单表达,VP1、VP4融合表达及共表达质粒经PCR及酶切鉴定,证明构建正确.各组核酸疫苗质粒均能诱导产生中和抗体,且具有一定的保护效力.VP1单表达组和联合组保护率均为28.6%;共表达组和融合表达组保护率均为42.9%;灭活疫苗组保护率为100%;空载体组保护率为0.结论 口蹄疫病毒VP1与VP4共存时能发挥更好的免疫原性.

二价重组鸡痘病毒口蹄疫疫苗的豚鼠免疫试验

目的 检测携带口蹄疫病毒(FMDV)Asia-1型P1-2A-IL18基因和O型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒疫苗诱导豚鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫的能力.方法 将重组鸡痘病毒vUTAL-P1-2A-IL18-P1-2A-3C、w-FPv和PBS分别经肌肉注射免疫豚鼠,检测豚鼠脾T淋巴细胞亚群数量、特异性CTL细胞杀伤活性和血清中抗FMDV特异性抗体水平.结果 重组鸡痘病毒免疫豚鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群数量和特异性CTL细胞杀伤活性均显著高于w-FPV和PBS对照组,且能产生抗O型和Asia-Ⅰ型FMDV特异性抗体.结论 二价重组鸡痘病毒口蹄疫疫苗能诱导豚鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫.

口蹄疫病毒多价DNA疫苗的构建及其免疫原性

目的 构建口蹄疫病毒(FMDV)多价DNA疫苗,并检测其免疫原性.方法 以复合多表位表达盒OAAT及Asia Ⅰ型FMDV的P1-2A-3C基因为基础,构建FMDV多价DNA疫苗pIRES-OAAT-PI-2A-3C,并用间接免疫荧光(IFA)方法 检测目的 蛋白在HeLa细胞中的表达.进一步进行小鼠免疫试验,并应用ELISA法检测小鼠血清抗体,ELISPOT检测小鼠脾淋巴单细胞IFN-γ的分泌水平.流式细胞术检测脾T淋巴细胞亚群数量,淋巴细胞转化试验检测特异性淋巴细胞增殖水平.结果 所构建的FMDV多价DNA疫苗在HeLa细胞中获得了正确表达.免疫小鼠后,血清特异性抗体水平、脾淋巴单细胞IFN-γ的分泌、脾T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+的数量及特异性淋巴细胞增殖水平均显著提高.结论已成功构建了FMDV多价DNA疫苗,并诱导小鼠产生了特异性的细胞免疫和体液免疫应答.

023 重组痘苗病毒诱导的抗口蹄疫病毒的保护性免疫力