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从骨骼肌线粒体膜电位探讨胰岛素抵抗机制
胰岛素抵抗在肥胖和2型糖尿病等疾病发病过程中起了重要作用.近来研究发现,骨骼肌线粒体功能障碍与胰岛素抵抗关系密切.导致骨骼肌线粒体功能障碍的因素有很多,骨骼肌线粒体发生功能障碍会出现形态上和功能上的变化,但研究尚不够深入.本研究试从线粒体膜电位角度来阐述线粒体膜电位变化与线粒体功能障碍及其骨骼肌数量和质量的关系,提出研究胰岛素抵抗机制的新方向.
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百草枯诱导AML12细胞凋亡过程中线粒体活性氧的作用
目的:探讨百草枯诱导小鼠肝细胞系AML12细胞凋亡过程中线粒体活性氧的作用.方法:AML12细胞分别给予o、25、50、100、200、300 μmol/L的百草枯处理.采用四甲基噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力;AnnexinV/PI双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡率;DCFH-DA荧光探针经流式细胞仪测定细胞内活性氧水平;MitoSOX荧光探针检测线粒体活性氧变化;激光共聚焦测定JC-1探针荧光强度以检测线粒体膜电位变化.结果:与对照组比较,25～300 μmol/L的百草枯处理后可以诱导AML12细胞活力下降,且具有剂量效应关系(r=-0.94,P＜0.01);300 μmol/L的百草枯作用24h可明显诱导AML12细胞发生凋亡(P＜0.05);25～300μmol/L百草枯处理24h后细胞内活性氧依次增加(P＜0.05),25～100 μmol/L百草枯作用24 h时线粒体活性氧增加且呈剂量效应关系(r=0.98,P＜0.05),而200和300 μmol/L的百草枯作用24h时线粒体活性氧水平降低(P＜0.05).细胞活力下降与细胞内活性氧升高呈负相关(r=-0.90,P＜0.05);晚期凋亡细胞的比例与细胞内活性氧呈正相关(r=0.96,P＜0.01);JC-1检测线粒体膜电位结果显示,与对照组相比,300 μmol/L的百草枯处理24 h时线粒体膜电位显著降低(P＜0.05).结论:百草枯诱导AML12细胞凋亡过程主要由细胞整体水平的活性氧介导,提示线粒体活性氧并未直接参与百草枯诱导的肝损伤过程.
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环孢霉素A对葡萄糖氧化酶诱导的HepG2线粒体功能损伤和细胞凋亡的保护作用
目的：探讨环孢霉素A(CsA)对葡萄糖氧化酶(GOX)诱导的肝细胞线粒体功能损伤和细胞凋亡的影响。方法：HepG2细胞分别给予不同浓度的GOX和CsA处理，MTT法检测细胞活力，确定所要选用的剂量和时间点。以10μmol/L的CsA预处理2 h，并给予25 U/L GOX处理12 h作为CsA+GOX组，同时设立空白对照组、GOX阳性对照组、CsA阴性对照组。分别采用AnnexinV/PI双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡率；GENMED活体细胞线粒体膜通道孔荧光试剂盒检测线粒体膜通透性转换；JC-1染色激光共聚焦检测线粒体膜电位变化；ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平；液相氧电极法检测线粒体耗氧量。结果：MTT结果显示GOX能诱导HepG2细胞活力下降，且呈现时间和剂量效应关系(P均<0.05)；与空白对照组比较，25 U/L GOX作用12 h可诱导HepG2细胞凋亡，同时伴有线粒体膜通道开放和膜电位下降，细胞内ATP水平和线粒体耗氧量下降(P均<0.05)，而10μmol/L的CsA预处理2 h有一定的保护作用，可以有效阻断线粒体结构功能的损伤，降低凋亡率，CsA+GOX组与GOX阳性对照组比较差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论：CsA对氧化应激诱导的肝细胞线粒体功能损伤和凋亡具有保护作用。
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姜黄素联合低浓度长春新碱抑制肝癌细胞系生长的实验研究
目的:研究姜黄素联合低浓度长春新碱对肝癌细胞系HepG2的生长抑制情况及可能机制.方法:实验设对照组(仅加培养基)、姜黄素组(20μmol/L)、长春新碱组(0.5、1、2、4μg/ml)及联合用药组(20μmol/L姜黄素+1μ g/ml),各组作用HepG2细胞24 h后,采用细胞计数法测定细胞增殖情况,克隆形成实验检测各处理组的长期效应,DAPI染色测定细胞的死亡方式,线粒体膜电位检测细胞的线粒体损伤情况,流式细胞术检测细胞DNA含量及细胞周期阻滞,RT-PCR检测LRP、MDR1和P21mRNA表达的变化.结果:与对照组和单独给药组比较,姜黄素联合长春新碱组经24 h处理后,明显抑制HepG2细胞增殖能力(P＜0.05)；克隆形成实验显示联合作用组明显抑制细胞集落形成能力；DAPI染色显示联合用药组凋亡细胞明显增加(P＜0.01),线粒体膜电位测定显示联合用药组膜电位减低可能与凋亡率增加相关；流式细胞术测定联合用药组G2/M期阻滞显著增加(P＜0.05)；RT-PCR检测到LRP、MDR1 mRNA的表达降低(均P＜0.05),而P21 mRNA的表达升高(P＜0.05).结论:姜黄素联合低浓度长春新碱可以显著抑制HepG2生长,为化疗新方案提供了一定依据.
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乙肝病毒表面蛋白对人精子活力及线粒体膜电位的影响
目的:乙肝患者的精于活力降低且有较高比例的凋亡和坏死,但其机制未明.本研究主要考察乙肝病毒表面蛋白(HBs)对人精子线粒体膜电位的影响. 方法:对经不同浓度的HBs(0、25,50、100 μg/ml)孵育4 h后的人精子活力进行分析,并进一步采用JC-1染料结合流式细胞术监测人精于线粒体膜电位的变化. 结果:与对照组比较,人精子在体外加入100 μg/ml HBs孵育后,a+b级精子数比例显著下降(P<0.01),精于线粒体膜电位显著下降,25、50、100 μg/ml HBs处理组丧失线粒体膜电位的精子百分率分别为24.83%、44.43%和92.22%. 结论:乙肝病毒可能通过表面蛋白HBs对人精子活力和线粒体膜电位产生负面影响.
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喹乙醇诱导HepG2细胞线粒体的氧化损伤
背景与目的:探讨喹乙醇(olaquindox)对人肝癌细胞(HepG2)线粒体的氧化损伤作用. 材料与方法:用0、200、400和800μg/ml喹乙醇处理HepG2细胞24 h后,采用噻唑蓝(MTT)法确定喹乙醇对HepG2细胞的IC50分子探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFDA)和双氢溴乙啶(dihydroethidium,DHE)检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量;罗丹明123检测线粒体膜电位(△Ψm)变化;钙离子荧光探针Fluo-3AM检测胞浆游离钙离子浓度并用定量PCR方法检测线粒体DNA(mtDNA)和核DNA(nDNA)的损伤情况. 结果:随着喹乙醇浓度的增加,HepG2细胞的存活率逐渐降低(P均<0.01),呈时间-剂量-反应关系;不同浓度的喹乙醇作用细胞24 h后,随着喹乙醇浓度的增加细胞内ROS和胞浆游离钙离子浓度显著增加(P<0.05或P<0.01),△Ψm明显降低且呈剂量-反应关系;喹乙醇能引起HepG2细胞mtDNA和nDNA损伤(P均<0.01),且mtDNA损伤程度显著高于nDNA,并呈剂量-反应关系. 结论: 喹乙醇在体外实验中,可诱导HepG2细胞线粒体氧化性损伤.
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邻-氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤SOSP-9607细胞作用及机理研究
目的:研究邻-氨基酚去甲表鬼臼毒素(ODE)抗骨肉瘤SOSP-9607细胞作用及机理.方法:采用MTT比色法测定体外抗骨肉瘤SOSP-9607细胞作用,透射电子显微镜观察细胞凋亡形态学;采用激光共聚焦显微镜测定SOSP-9607细胞内Ca2+、Mg2+,pH值和线粒体膜电位(MMP)的荧光强度;免疫细胞化学技术检测细胞内Bcl-2和Bax表达.结果:ODE时间、浓度依赖性地抑制SOSP-9607细胞生长,诱导细胞凋亡具有典型的凋亡形态特征如细胞膜表面微绒毛消失、核固缩、核碎裂等;剂量依赖性地增加SOSP-9607细胞内Ca2+,Mg2+浓度而降低细胞内pH值和线粒体膜电位:使SOSP-9607细胞内Bcl-2蛋白表达下降而Bax蛋白表达增加.结论:邻-氨基酚去甲表鬼臼毒素在体外实验中能明显抑制骨肉瘤SOSP-9607细胞生长,其作用机制可能与改变细胞内环境稳态及Bcl-2和Bax蛋白表达而诱导细胞凋亡有关.
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抗Eppin抗体对成熟精子的损伤及其凋亡
目的 研究抗附睾蛋白酶抑制剂(Eppin)抗体对人成熟精子常规指标及其凋亡情况的影响,从而探讨Eppin抗体对精子的损伤机制.方法 将正常男性精液标本经过精子培养液BWW稀释为20×106·ml-1后分为7组:空白对照组、兔IgG抗体组和不同浓度抗Eppin抗体组(浓度分别为2.5、5、10、20和40ug·ml-1)共同孵育4h后,检测精子活力、精子凋亡率以及精子线粒体膜电位的改变.结果 当抗Eppin抗体浓度达到5 ug·ml-1后,精子发生明显的凋亡,浓度达到20ug·ml-1后,精子的动力降低,同时在随着抗Eppin抗体浓度的增高,会发现线粒体膜电位的降低.结论 抗Eppin抗体作为抗精子抗体的一种,当其浓度比较低时,不会对精子的动力造成明显影响.但当到达某一浓度时,会对精子产生损伤作用.
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过氧化氢通过激活氧化应激诱导成骨细胞凋亡
目的：探讨氧化应激状态诱导成骨细胞系 MC3T3-E1凋亡中线粒体途径的作用。方法：采用 MTT 法检测不同浓度过氧化氢处理后 MC3T3-E1的增殖情况；Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测细胞凋亡；JC-1流式细胞学检测线粒体膜电位；DCFH-DA流式检测ROS活性。结果：MC3T3-E1过氧化氢处理后，细胞增殖明显抑制呈剂量效应关系，ROS 活性和凋亡增加，线粒体膜电位降低。结论：过氧化氢可以增加细胞内 ROS 水平，通过激活线粒体途径诱导细胞凋亡。
