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Tankyrase的结构和功能的研究进展
随着人类对基因损伤修复机制研究的不断深入,聚腺甘二磷酸核糖聚合酶(polyADP-ribose polymerase,PARP)在损伤修复过程中所起的作用也越来越清晰,并且发现PARP是一个家族酶,包括5个成员:PARP-1,PARP-2,PARP-3,Tankyrase(TRF1-interacting ankyrin related ADP-ribose polymerase)和V-PARP[1].PARP-1,-2在基因的损伤过程中起作用,而Tankyrase、V-PARP在机体中有其独立的功能[2].近来越来越多的人们对Tankyrase进行了研究,发现其有2种Tankyrase-1和Tankyrase-2.
关键词： 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP) Tankyrase 结构 功能 -
恶性血液病细胞中tankyrase表达与端粒酶活性关系研究
为研究以白血病为主的恶性血液病细胞中端粒酶活性正向调控基因tankyrase的表达与端粒酶活性的关系并初步探讨tankyrase对端粒酶活性调控的机理和意义,以实时定量RT-PCR技术对髓细胞系白血病细胞株K562,HL-60,U937,NB4,THP-1,HEL,Dami,T淋巴细胞性白血病细胞株6T CEM,Jurkat和B细胞淋巴瘤细胞株Raji中tankyrase的表达进行检测,同时检测端粒酶逆转录酶hTERT的表达确定端粒酶活性,并以经磁珠分离的正常人CD3+,CD19+和CD33+细胞和10份正常人骨髓单个核细胞做对照.结果发现:tankyrase在恶性血液病细胞株中的表达明显高于正常对照(U=19,P＜0 01),其中髓系白血病细胞株中的表达高于正常人CD33+细胞,T淋巴细胞性白血病细胞株和B细胞淋巴瘤细胞株中的表达分别高于正常人CD3+和CD19+细胞.髓系恶性血液病细胞株tankyrase的表达(0.0032±0.0010)明显低于淋系恶性血液病细胞株的表达(0.012±0.0016)(F=23,P＜0.01).Tankyrase与hTERT的表达呈正相关(相关系数为0.395,P＜0.05).结论:tankyrase在恶性血液病细胞株中呈高表达,与端粒酶活性呈正相关,提示tankyrase可能是恶性血液病中端粒酶活性增高的原因之一.
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Tankyrase与端粒酶在大鼠肝癌发生中的表达变化
目的:探讨tankyrase与端粒酶在肝细胞肝癌发生、发展过程中的动态变化及其相关性.方法:SD大鼠随机分为对照组(n=42)和造模组(n=42),二乙基亚硝胺诱导大鼠肝细胞肝癌模型.给药后3,6,9,12,15,18,21 wk随机处死对照组及造模组中的6只大鼠.采用Western blot法检测tankvrase和端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)的表达;免疫荧光方法原位检测细胞内TERT的表达;TRAP法检测端粒酶活性;免疫组化方法检测细胞增殖活性(Ki-67).结果:在肝细胞癌变过程中,相对于端粒酶、TERTTZKi-67在正常组织和癌前病变中的低水平表达,tankyrase在肝炎期表达就显著增加.但至肝硬化,特别是肝癌期几种检测指标的表达均至高峰.Tankyrase与端粒酶活性和TERT的表达呈正相关(r=0.898,P=0.038;r=0.943,P=0.016),但与细胞的增殖活性无相关性;而细胞增殖活性与端粒酶和TERT呈正相关(r=0.986,P=0.002;r=0.93,P=0.022).结论:Tankyrase可能是调控端粒酶行使功能的因素之一.Tankyrase、端粒酶、TERT和Ki-67均与肝细胞肝癌的发生、发展密切相关.
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Ni2+亲和胶的制备及其对带His6标签融合蛋白的纯化
目的:制备Ni2+亲和胶,并检测其纯化带His6标签融合蛋白的效果.方法:在强碱条件下,用环氧氯丙烷活化Sepharose 4B后,接上多个IDA臂,将Ni2+连接在IDA臂上,即为亲和胶成品.用亲和胶分别在变性和非变性的条件下,纯化包涵体和可溶性表达的带His6标签的人TRF1 和人tankyrase的PARP结构域,并通过Western印迹鉴定纯化的靶蛋白.结果:用自制的Ni2+亲和胶可以获得SDS-PAGE单一条带的目的蛋白,并得到Western印迹的鉴定.结论:自制的Ni2+亲和胶对带His6标签融合蛋白的纯化能力与商品胶完全等同,但价格低廉.
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化学致癌物转化细胞端锚聚合酶mRNA的表达
[目的]探讨3种化学致癌物诱发细胞恶变后tankyrase mRNA的表达.[方法]用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测正常细胞和恶性转化细胞tankyrasemRNA的表达.[结果]tankyrase mRNA在转化细胞中的表达高于正常细胞.[结论]3种化合物诱发的细胞恶性转化涉及了tankyrase活性改变,提示tankyrase mRNA高表达可能与化学致癌有关.
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正义Tankyrase转染大鼠海绵体平滑肌细胞的作用研究
目的 构建正义Tankyrase真核表达载体,探讨其转染大鼠海绵体平滑肌细胞的作用.方法 (1)构建及鉴定正义Tankyrase真核表达载体;(2)正义Tankyrase重组质粒(pcDNA-TNKS)转染大鼠海绵体平滑肌细胞,进行DNA水平、RNA水平鉴定;(3)端粒酶活性的定量检测(TRAP-ELISA法)、端粒长度的检测(Southern blot法)及生长曲线(MTT法)的检测.结果 (1)成功构建正义Tankyrase真核表达载体;(2)正义Tankyrase重组质粒成功转染大鼠海绵体平滑肌细胞;(3)TNKS转染细胞(SMC-TANKS)、空载转染细胞(SMC-Zeo)及未转染细胞(SMC)的端粒酶活性无显著性差异(P＞0.05);(4)SMC-TANKS的端粒长度较SMC-Zeo及SMC长(P＜0.01)(5)SMC-TANKS的光密度(OD)值显著高于SMC-Zeo及SMC(P＜0.01).结论 正义Tanks重组质粒转染有助于改变海绵体平滑肌细胞的端粒长度而延长细胞寿命.
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人反义Tankyrase逆转录病毒载体的构建
目的:研究人反义Tankyrase逆转录病毒载体的构建,探讨以tankyrase为靶点的肿瘤基因治疗的可能性.方法:将Tankyrase的cDNA反向插入逆转录病毒载体pLXRN中,转染包装细胞PT67后获得反义重组病毒.结果:经Hind Ⅲ酶切鉴定,反义重组子可产生200 bp的条带,与理论计算值完全一致.结论:成功构建了人Tankyrase的反义逆转录病毒载体.
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Tankyrase--一种多功能的端粒结合蛋白
Tankyrase是一种与人类端粒有关的二磷酸腺苷核糖多聚合酶,早是通过与TRF1结合而被发现,是人类端粒的正性调节因子.近几年研究发现,有丝分裂期的核孔复合物、中心体,减数分裂期的纺缍体和分裂间期的高尔基体也存在着大量Tankyrase,提示Tankyrase是一种多功能蛋白.现就Tankyrase和Tankyrase2的结构和功能作一综述.
关键词： 端粒酶 Tankyrase 端粒重复序列结合因子 -
正反义人Tankyrase基因真核表达载体的构建及鉴定
目的: 构建人Tankyrase正义和反义真核表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从TT20质粒上切下约3.44 kb的Tankyrase cDNA片段,然后连入pcDNA3.1/Zeo的EcoR Ⅰ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.0+3.4 kb两条带,而反义重组质粒为8.2+0.2 kb两条带,与理论计算值完全一致. 结论: 成功构建了人Tankyrase的正、反义真核表达载体.
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结晶型硫化镍诱发细胞恶变过程中端锚聚合酶mRNA的表达
背景与目的:探讨结晶型硫化镍(NiS)诱发人支气管上皮细胞恶变过程中端锚聚合酶(tankyrase)mRNA的变化.材料与方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测细胞tankyrase mRNA的表达.结果:Tankyrase在细胞恶变过程中不同阶段细胞的表达均高于正常细胞.结论:结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞恶性转化涉及了tankyrase活性改变,tankyrase活性改变可能是结晶型NiS诱发肺癌的早期分子事件.
