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用体外微核试验评价番茄红素的抗突变性
番茄红素(lycopene,LCP)是成熟番茄中的主要色素,也是常见的类胡萝卜素之一.LCP具有独特的长链烯烃分子结构,可表现出抗氧化、抑制突变、降低DNA损伤、降低心血管疾病和癌症发生危险性等多种种功能[1].已大量用作保健食品的原料.本课题采用人类淋巴母细胞TK6的体外微核试验,对LCP的抗诱变性进行评价,为其作为药品、保健品原料的进一步开发利用提供毒理学依据.
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彗星试验检测叶绿素的抗诱变性
单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis,SCGE),又称彗星试验(comet assay),是由Ostling和Johansont[1]于1984年先提出,后经Singh等[2]进一步完善的一种用于检测单个细胞DNA损伤与修复的新技术.根据裂解和电泳的pH条件不同,分为中性单细胞凝胶电泳和碱性单细胞凝胶电泳,分别可检测DNA双链和单链断裂,目前应用多广泛的是检测DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳[3].细胞DNA受损愈严重,产生的DNA断片就愈多,断片也愈小,电泳表现为彗星尾长增加和尾部荧光增强.
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氢醌诱导TK6细胞miR-221表达异常致PARP-1基因下调的机制
目的 探讨氢醌(HQ)致TK6细胞PARP-1基因表达下调的机制.方法 以磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0和10.0 μmol/L HQ染毒TK6细胞为染毒组.应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测miR-221的表达改变,以蛋白印迹法检测PARP-1蛋白表达量,以生物信息学方法分析miR-22l的潜在甲基化相关靶基因.结果 与对照组相比,2.5、5.0和10.0 μmol/L HQ组细胞PARP-1蛋白量逐渐下降,5.0和10.0μmol/L HQ组miR-221表达量分别下降17%(P＜0.05)、42%(P＜0.05).miR-221能与MBD2 mRNA的3'非翻译区(UTR)形成调控复合体.结论 HQ致PARP-J基因下调机制可能与miR-221表达异常有关.
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CpG岛甲基化结合蛋白在氢醌致骨髓增殖性白血病病毒原癌基因转录激活中的作用
目的 深入揭示氢醌(HQ)致MPL转录激活的表观遗传学机制.方法 以磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以正常TK6细胞、PBS处理细胞为对照组,分别以2.5、5.0、10.0和20.0 μmol/L HQ染毒TK6细胞为染毒组.应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测甲基化CpG结合蛋白1～5 (MBDI～5)的表达.结果 与对照细胞相比,MBD1～4的mRNA表达量在所有的HQ处理细胞中全部下降,20.0μmol/L HQ对MBD2和MBD4表达的抑制效果为明显,抑制率分别为50％和32％(P＜0.05);而10.0 μmol/L HQ对MBD1和MBD3表达的抑制效果明显,抑制率分别为36％和33％(P＜0.05);MBD5表达无统计学意义(P＞0.05).在MPL的CpG岛内有3个MBD1序列特异性结合位点.结论 HQ致MPL的转录激活可能与MBD1表达异常有关.
关键词： 氢醌 TK6细胞 CpG岛甲基化结合蛋白 转录 -
基于慢病毒介导RNA干扰技术的人PARP-1基因沉默细胞株构建
目的 利用慢病毒介导的RNA干扰技术构建人淋巴母细胞TK6细胞的PARP-1基因沉默细胞株,为后续PARP-1基因功能和表观遗传学调控机制的研究提供有效的工具细胞.方法 利用瞬时转染方法筛选佳干扰效果的shRNA片段,与慢病毒载体pLVX-shRNA1连接,形成重组质粒,DNA测序鉴定后进行病毒包装,转导TK6细胞,利用嘌呤霉素筛选得到稳定表达PARP-1 siRNA的PARP-1沉默细胞株,并用定量PCR和Western blotting鉴定所构建的细胞株.结果 转染shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4细胞的PARP-1相对表达量分别为0.289、0.538、0.375和0.474,故选择shRNA1作为干扰PARP-1基因佳片段.用0.5μg/ml的嘌呤霉素成功筛选出PARP-1沉默细胞株和空载体对照细胞株,并从mRNA、蛋白质、细胞表型来检测PARP-1基因的干扰效率,抑制效率超过80％.结论 成功构建PARP-1的siRNA慢病毒干扰载体,并筛选出PARP-1基因沉默的TK6细胞株,携带shRNA的慢病毒稳定、高效干扰PA RP-1基因表达.
关键词： 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 RNA干扰 慢病毒 TK6细胞 -
SIRT1在氢醌诱导TK6细胞凋亡中的作用
目的 构建TK6细胞的沉默信息调节因子1(SIRT1)基因沉默细胞株(TK6-shSIRT1),初步探讨SIRT1在氢醌诱导TK6细胞凋亡中的作用.方法 应用慢病毒介导的RNA干扰技术构建TK6细胞的SIRT1沉默细胞株,并用qPCR和Western blotting联合鉴定干扰效果,比较两种细胞的一般生物学特性(细胞形态、细胞增殖能力和细胞周期分布).用不同浓度HQ (2.5 ～40 μmol/L)处理TK6和TK6-shSIRT1细胞48 h后,以CCK-8法检测细胞存活率;以流式细胞术检测细胞周期及凋亡的改变.结果 成功筛选出稳定表达的人淋巴母细胞SIRT1缺陷细胞株,与TK6正常细胞株相比,TK6-shSIRT1细胞中SIRT1在mRNA和蛋白表达水平分别下降了84.6％和94.5％,且生长速度加快了6.57 h,增殖指数增加了11.8％,差异均有统计学意义(P＜0.05),但细胞形态未出现明显改变.经HQ短时间处理后:两种细胞存活率均呈剂量依赖性降低;相同染毒剂量条件下,TK6-shSIRT1细胞的存活率均明显低于TK6细胞(P＜0.05),细胞早期凋亡率高于TK6细胞(P＜0.05).结论 SIRT1缺陷可增加TK6细胞对HQ的敏感性.
关键词： 氢醌 沉默信号调节子1(SIRT1) TK6细胞 凋亡 -
人类淋巴母细胞TK6检测环磷酰胺诱发微核及TK基因突变的体外实验研究
目的建立TK6细胞检测环境诱变剂诱发微核及TK基因突变的实验方法.方法用诱变剂环磷酰胺(CP)体外染毒TK6细胞4h后检测细胞毒性,微核及tk位点突变频率.结果CP处理导致TK6细胞的相对存活率下降,细胞微核率及TK基因突变频率明显上升,并均有剂量-反应关系.高浓度组(4.0μg/m1)的细胞微核率及TK基因突变频率分别是对照组的8.8和15.7倍.CP诱发tk位点两种不同表型的突变细胞集落,即正常生长突变体集落及缓慢生长突变体集落,并以后者为主.结论CP可以诱发TK6细胞微核及TK基因突变,揭示CP可能是一种断裂剂.TK6细胞可用于评估环境化学物细胞水平遗传改变及TK基因突变.
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姜黄素对TK6细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用研究
目的: 观察姜黄素(curcumin)对人的类淋巴母细胞TK6细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,为进一步探讨其抗诱变、抗肿瘤的机制和开发利用提供理论依据. 方法: 姜黄素处理TK6细胞,采用MTT比色分析法、3H-TdR掺入法和细胞周期测定以及细胞超微结构观察和流式细胞分析. 结果: 20 μmol/L的姜黄素处理细胞24 h,即可产生显著的细胞增殖抑制作用和凋亡诱导作用,且有剂量和时间依赖性.姜黄素引起细胞的凋亡主要在细胞周期的DNA合成期(S期),将细胞周期阻滞在静止期和DNA合成前期(G0/G1期). 结论: 姜黄素对TK6细胞具有显著的增殖抑制作用和凋亡诱导作用.
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白血病相关原癌基因在氢醌处理TK6细胞中的表达
目的 探索氢醌(hydroquinone,HQ)致DNA整体低甲基化的后续结果.方法 用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0、10.0和20.0 μmol/L HQ染毒TK6细胞为处理组.应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测白血病相关原癌基因MPL、BRAF、ERBB2、MYB、MYC和RAF1的表达水平.结果 与对照细胞相比,HQ处理细胞MPL和RAF1的mRNA表达量都随HQ剂量增加而上升,其中20 μmol/L HQ对原癌基因表达的影响为明显,分别上升了80％ (P ＜0.05)和35％ (P＜0.05)；MYB、MYC和ERBB2基因的mRNA表达量随HQ的剂量上升而下降.结论 MPL的转录活化很有可能与HQ导致的DNA整体低甲基化有关.
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氢醌对TK6细胞周期的影响及其相关的调控机制探讨
[目的]探讨氢醌(hydroquinone,HQ)对细胞周期的影响及其相关的调控机制.[方法]磷酸盐缓冲液(PBS)处理人类淋巴母细胞(TK6细胞)为对照组,20.0 unol/L HQ为处理组,48h后通过碘化丙啶(PI)标记的流式细胞术检测细胞周期分布情况,用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测PTEN(抑癌基因)、p53基因mRNA表达的改变,流式细胞荧光标记法检测Rb蛋白的表达. [结果]与对照组比较,处理组G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少,差异均有统计学意义(P＜0.05); HQ作用于TK6细胞后上调了Rb的表达,下调了p53的表达,其差异均有统计学意义(P＜0.05),而对PTEN的表达没有明显影响. [结论]HQ可能通过上调Rb的表达使细胞阻滞于G1期.
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CCK-8试剂在血液毒理学检测中的应用
目的:优化CCK-8试剂盒在血液毒理学检测中的应用条件.方法:以CCK-8试剂盒标准检测法和两种优化的方法分别检测不同浓度的氢醌(hydroquinone,HQ)对TK6细胞增殖速度的影响,分别与计数法比较,分析影响实验检测的原因.结果:试剂盒标准方法中,HQ对CCK-8试剂的检测结果有影响,结果出现偏差,优化后的两种方法与计数法检测结果较为相似.结论:HQ对CCK-8试剂检测结果有影响,优化出一种适用于HQ血液毒理学检测的细胞增殖方法.
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氢醌引起TK6细胞毒性的差异蛋白组学研究
目的 研究氢醌对人淋巴母细胞株TK6细胞蛋白质表达的影响,探讨氢醌引起细胞应答反应的分子机制.方法 采用浓度为20.0μmol/L的氢醌处理TK6细胞24.0 h,用蛋白裂解液提取细胞总蛋白并进行定量,以双向凝胶电泳分离蛋白质,图像分析后选取电泳差异点进行胶内酶解,采用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱法进行质谱鉴定.以浓度为0.0、5.0、10.0、20.0μmol/L的氢醌处理TK6细胞24.0 h,提取总蛋白后,采用免疫印迹法对质谱鉴定出的热休克蛋白70(HSP70)和泛素结合酶2(UBE2N)的蛋白表达进行检测.结果 氢醌处理后引起48个蛋白质差异化表达,质谱鉴定出30个表达上调或下调的差异蛋白,功能包括氧化应激、线粒体能量代谢、细胞骨架、细胞周期以及DNA损伤修复等.5.0、10.0、20.0μmol/L氢醌组TK6细胞的HSP70和UBE2N蛋白相对表达水平均高于0.0μmol/L氢醌组(P<0.05),与质谱结果一致.结论 氢醌能够通过氧化应激引起TK6细胞毒性,由此引发线粒体能量代谢的改变和DNA损伤修复来进行的应答.
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低剂量氢醒对TK6淋巴母细胞生物学性状及miR-221表达影响
目的 探讨低剂童氮醌(HQ)对TK6淋巴母细胞的生物学性状及小分子非编码RNA(microRNA)-221(miR-221)表达的影响.方法 磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0和10.0 μmol/L HQ染毒TK6细胞为处理组.应用CCK-8试剂盒检测细胞活力和细胞增殖,通过磷脂结合蛋白(Annexin V)/碘化丙啶(PI)标记的流式细胞技术检测细胞调亡,用实时荧光定童-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测milR-221的表达改变.结果 细胞增殖以48 h为明显,2.5、5.0和10.0 μmol/L组细胞增殖指数分别为1.33(P<0.05)、1.14(P<0.05)和1.12(P<0.05);milR-221表达改变以72h为明显,2.5、5.0、10.0 p.μmol/L HQ组细胞milR-221表达量分别抑制了0.31倍(P<0.05)、0.39倍(P<0.05)和0.33倍(P<0.05).结论 低剂量HQ能抑制TK6细胞调亡和milR-221的表达,促进细胞增殖.
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用TK基因和HGPRT基因突变试验检测人参皂甙Rg1的抗诱变性
[目的]用TK基因和HGPRT基因突变试验评价人参皂甙Rg1的抗诱变性,为其进一步的开发利用提供资料.[方法]用人参皂甙Rg1 0.391、3.125、25、200μg/ml与阳性致突变物甲基磺酸甲酯(MMS)5μg/ml同时处理TK6细胞4h,采用微孔板法检测tk和hgprt两个位点突变频率.[结果]随受试物剂量的增加,人参皂甙Rg1拮抗MMS诱变性的作用增大,表现在tk和hgprt两个位点突变频率均较MMS组降低,差异有统计学意义(P<0.05).[结论]人参皂甙Rgl具有拮抗MMS诱导的tk基因和hgprt基因突变的作用;TK6细胞可用于TK基因和HGPRT基因突变的同时检测,但TK基因突变试验比HGPRT基因突变试验更为敏感.
关键词： 人参皂甙Rg1 TK6细胞 TK基因突变试验 HGPRT基因突变试验 -
用TK基因突变试验评价大蒜素的抗诱变性
[目的]用TK6人类淋巴母细胞的TK基因突变试验评价大蒜素的抗诱变性,为大蒜素抗诱变作用及其可能机制的研究提供毒理学依据,并为TK基因突变试验在抗诱变性检测方面的应用及推广积累资料.[方法]设溶剂对照组、5 μg/ml MMS组、5 μg/ml MMS+大蒜素0.1 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml试验组、5 μg/ml MMS+100μg/ml VitC对照组.分别采用同时处理和后处理两种方法测定PEO、PE3、RS和TFT.[结果]大蒜素在两种处理条件下均能显著降低MMS诱导的TK基因突变频率,并呈较好的量效关系,两种处理条件的作用强度差异无统计学意义.[结论]在本实验条件下,大蒜素可抑制MMS诱导的TK6细胞TK基因突变,有很好的开发应用前景.
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TK基因突变试验检测叶绿素的抗诱变性
目的:用人的类淋巴母细胞TK6的TK基因突变试验检测叶绿素的抗诱变性.方法:不加S9活化的条件下,用叶绿素10、20、40、80μg/ml与阳性致突变物丝裂霉素C(MMC)0.5μg/ml同时处理TK6细胞3 h,采用微孔板法进行平板接种效率和突变频率的测定.结果:随受试物剂量的增加,叶绿素对MMC诱变性的拮抗作用增大,当剂量达到40μg/ml以上时总突变频率较MMC组有显著降低(P＜0.05).结论:叶绿素具有拮抗MMC诱导的tk基因突变的作用.
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微囊藻毒素MCLR导致TK6细胞tk位点杂合性丢失的分析
目的:应用人类淋巴母细胞TK6研究微囊藻毒素Microcystin-LR(MCLR)的体外遗传毒性分子机理.方法:藻毒素MCLR(80μg/ml)体外染毒TK6细胞24h后检测tk位点突变频率并进行TK基因缺失突变体LOH的分析.结果:MCLR染毒导致TK6细胞相对存活率下降,TK基因突变频率明显上升,达到对照的5.1倍.MCLR诱导产生半合子LOH(41.7%)的比例是对照(20.7%)的两倍.结论:体外24h染毒TK6细胞MCLR可致突变并表现出断裂剂特性,诱发杂合性丢失而非点突变.
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用TK基因突变试验评价大豆低聚肽的抗诱变性
[目的]了解大豆低聚肽的抗诱变作用,为其进一步开发利用提供依据. [方法]采用TK6细胞TK基因突变试验,以前处理、同时处理、后处理3种方式给予大豆低聚肽,观察4个剂量大豆低聚肽(1.25、2.5、5.0、10.0mg/ml)对MMS诱导的tk基因突变频率的影响. [结果]在前处理与同时处理条件下,4个剂量的大豆低聚肽均可显著降低MMS诱导的tk基因突变频率,并呈良好的剂量反应关系;而后处理条件下,大豆低聚肽仅在5.0和10.0 mg/ml时表现出对MMS的拮抗作用;大豆低聚肽前处理时的tk基因突变指数亦显著低于其余两种处理方式. [结论]大豆低聚肽具有良好的抑制MMS诱导的tk基因突变的作用,以前处理方式的抗诱变作用强.
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长春花碱诱导TK6细胞tk位点杂合性丢失的研究
目的建立用人类淋巴母细胞TK6检测纺锤体毒物--长春花碱的TK基因突变试验方法,同时探讨长春花碱的遗传毒性分子机理.方法使用长春花碱0.625 ng/mL、1.250 ng/mL、2.500 ng/mL和5.000 ng/mL对TK6细胞染毒24 h,进行TK基因突变试验.检测细胞相对存活率(RS%)、相对悬浮增长率(RTG%)、tk位点突变频率(MF)和缓慢生长集落的百分比(SC%),同时对突变集落tk位点杂合性丢失(LOH)进行分析.结果随着长春花碱浓度的增加,TK6细胞的相对存活率和相对悬浮增长率均降低,而tk位点突变频率逐渐增加,且有剂量反应关系.tk位点杂合性分析表明长春花碱诱发的突变集落中有96.4%为LOH丢失,其中半合子LOH为39.3%,纯合子LOH为57.1%.结论长春花碱可诱导TK6细胞tk基因突变,主要以LOH为主.
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环磷酰胺诱导TK6细胞TK基因杂合性丢失的实验研究
目的应用人类淋巴母细胞TK6研究环磷酰胺(CP)遗传毒性分子机理.方法 CP+S9体外染毒TK6细胞4 h后检测细胞相对存活率、tk位点突变频率并进行TK基因缺失突变体杂合性丢失(LOH)的分析.结果环磷酰胺染毒导致TK6细胞相对存活率下降,TK基因突变频率上升,并呈现剂量-反应关系.正常及缓慢生长突变集落倍增时间分别为(14.6±1.74) h及(35.8±3.78)h.环磷酰胺诱导产生半合子LOH的比例(50%)是对照(20.7%)的2.4倍.结论环磷酰胺对TK基因较大范围的损伤是导致基因突变的主要原因.
