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肥厚型心肌病患者超极化激活环核苷酸门控阳离子通道mRNA的表达
目的 探讨肥厚型心肌病患者超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)的表达.方法 构建重组质粒,用梯度稀释的质粒模板建立SYBRGreen荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测HCN4的标准曲线,利用建立的RT-PCR体系对肥厚型心肌病和正常心肌组织标本的左室HCN4 mRNA进行检测.结果 成功构建了质粒重组子,并建立用SYBRGreen荧光染料在RNA水平检测HCN4通道的标准曲线.HCN4通道在肥厚型心肌病中的表达水平高于正常心肌.结论 肥厚型心肌病患者HCN4 mRNA的表达较正常人增高.
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干扰素抗体对干扰素疗效的影响
1材料与方法1.1病例选择 56例慢性乙型肝炎患者为2000年1月～12月本院住院病人,男39例,女1 7例,年龄24～61岁.诊断符合1995年第5次全国传染病与寄生虫病学术会议修订的标准.1.2治疗方法所有患者均给予α-2b干扰素3MU肌肉注射,1次/d,1 5d后改为3次/W,疗程3个月.于治疗前、治疗中、治疗结束时检测ALT,HBV DNA含量及干扰素抗体,将治疗3个月后ALT下降至正常、血清HBV DNA含量下降,出现HBeAg/抗HBe血清转换者定为有应答.1.3检测方法 HBeAg、抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc,均采用酶联免疫法测定,试剂采用上海科华公司产品,血清干扰素抗体检测采用酶联免疫吸附实验,试剂由上海森雄公司提供.血清HBV DNA:定性检测采用PCR法;定量检测采用荧光定量PCR技术、美国Biotronic公司AG-9600Amplisensor.Assay系统及其配套试剂盒.2结果2.1干扰素抗体与HBV-M的关系治疗前56例患者中4例血清干扰素抗体阳性,阳性率为7.14%,治疗后16例血清干扰素抗体阳性,阳性率为28.57%.16例血清干扰素抗体阳性患者HBeAg/抗HBe转换5例(31.25%),HBV DNA阴转5例( 31.25%),而干扰素抗体阴性的36例患者发生HBeAg/抗HBc转换12例(33.33%),HBV DNA阴转11例(30.56%),两组相比,无显著性差异.2.2对ALT的影响16例干扰素抗体阳性患者治疗前ALT均值195士163U/L,治疗后为42±1 6U/L,36例干扰素抗体阴性患者治疗前ALT均值185士148U/L,治疗后为37±20U/L,两组相比,ALT复常无显著差异.
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荧光定量PCR法在丙型肝炎病毒核糖核酸检测中的应用
目的:通过与荧光半定量PCR及传统逆转录PCR(RT-PCR)比较,探讨荧光定量PCR(FQ-PCR)在丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV RNA)检测中的应用价值.方法:采用FQ-PCR、荧光半定量PCR及RT-PCR三种方法同步检测180例丙型肝炎患者HCV RNA含量,所得结果采用χ2检验.结果:FQ-PCR在血浆中及单个核细胞中的阳性检出例数多,分别占78.3%和83.7%.无论是在血浆中或单个核细胞测定,FQ-PCR阳性检出率均明显高于同步检测的荧光半定量PCR及RT-PCR(P＜0.01).以RT-PCR为标准,当HCV RNA水平在103~5copies/ml时,FQ-PCR和荧光半定量PCR阳性检出水平相一致(P＞0.05),明显高于RT-PCR(P＜0.01).当HCV RNA 水平在106~7copies/ml时,3种检测方法的阳性检出率基本相同(P＞0.05).结论:FQ-PCR检测HCV RNA 具有高灵敏度、高特异性,且二次污染的可能性小.
关键词： 荧光定量 聚合酶链反应 丙型肝炎病毒核糖核酸 -
乙型肝炎患者血清HBeAg与HBV DNA含量的关系及其临床意义
目的:比较乙型肝炎患者血清中HBeAg含量与HBV DNA含量之间的关系并分析其临床意义.方法:采用微粒子发光分析法检测122例患者血清中HBeAg含量,同时采用荧光定量PCR法检测患者血中HBV DNA含量,并进行比较分析.结果:HBeAg含量＞134 PEIU/L组的患者血清HBV DNA平均含量(6.93E±1.03copies/ml)显著高于HBeAg含量0.28～134 PEIU/L组患者的HBV DNA含量(5.58E±1.84 oopies/ml)(t=4.03,P＜0.001),在HBeAg阴性组中有52%的患者仍可检出HBV DNA(2.9E±2.44 copies/ml).122例患者血清HBeAg和HBV DNA的含量高低与ALT(丙氨酸氨基转移酶)无相关关系.结论:血清中HBeAg的含量与HBV DNA含量有一定相关性,与ALT无相关关系,临床应结合两者对病情进行综合判断.
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56例乙型肝炎患者血清HBV DNA定量分析
目的:通过对乙型肝炎病毒(HBV)DNA的含量分析,进一步探讨适用于临床基因诊断的有效手段.方法:采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术,对56例乙型肝炎患者血清进行病毒定量检测,并与常规定性PCR和杂交梳方法进行对比观察.结果:FQ-PCR阳性检出率明显高于杂交梳法及常规PCR法,其阳性率依次为:92.80%、78.57%和46.43%.结论:FQ-PCR技术,不仅可减少操作过程中出现的假阳性,而且能真实可靠的反映病毒复制情况,大大提高乙肝病毒的检出率,对临床诊断、药物筛选及疗效考核都有着重要指导意义.
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荧光定量PCR检测沙眼衣原体结果分析
为了解相关疾病中沙眼衣原体(CT)感染的流行病学特征,采用荧光定量PCR检测CT-DNA.结果共检测1770例,其中沙眼衣原体阳性455例,占25.7%.结论依据检测结果及追询病史,可见沙眼衣原体感染可致较严重的性传播疾病.因此必须早检查、早治疗,防止扩大感染,同时从病原学的角度对CT在我国的流行情况进行调查也是非常必要的.
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密骨方对去势后骨质疏松性骨折模型大鼠骨痂BMP-3mRNA表达的研究
目的 应用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测密骨方在去势后骨质疏松性骨折模型大鼠骨折愈合过程中的骨形态发生蛋白(BMP)-3mRNA水平.方法 建立Wistar大鼠去势后骨质疏松性骨折的动物模型和BMP-3mRNA表达水平的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法,分别于术后第2、4、6周取断端组织,通过荧光定量RT-PCR检测标本中BMP-3mRNA水平.结果 大鼠骨组织BMP-3mRNA表达水平:在时间上的总体比较呈递减的趋势并有显著性差异(F=153.19,P<0.05);组别的总体比较是模型组<实验组<对照组,并有显著性差异(F=262.23,P<0.05);在时间与组别的交互比较也存在显著性差异(F=81.50,P<0.05);任两组间都有统计学差异(P<0.05).结论 中药密骨方对去势后骨质疏松性骨折大鼠模型的骨折愈合有促进作用.
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HBV-DNA与HBVM结果分析及临床应用评价
本研究采用荧光定量PCR方法,检测了342例不同HBV感染状况的患者血清HBV-DNA含量,旨在探讨HBV-DNA含量及其与乙肝病毒标志物(HBVM)在反映体内乙肝病毒(HBV)复制方面存在的差异,进一步评价HBVM的临床意义.
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血清乙肝病毒抗体与HBV-DNA关系的临床分析
由于分子生物学技术的迅猛发展,人们对乙肝病毒(HBV)相关抗体,尤其是抗-HBs的临床意义有了新的认识.就此本院门诊收集122例HBV相关抗体阳性血清,应用全自动荧光定量PCR仪来检测血清HBV-DNA(拷贝/mL)与相关抗体间的关系.
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湖南地区尖锐湿疣患者感染HPV类型分析
目的分析湖南地区尖锐湿疣(CA)的发病人群及其人类乳头瘤病毒(HPV)的型别.方法采用荧光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)技术检测尖锐湿疣皮损中人乳头瘤病毒基因.结果 50例尖锐湿疣患者年龄40岁以下占80%.50例尖锐湿疣标本经FQ-PCR检测后44例HPV阳性,阳性标本中6/11型42例(84%),1 6/18型1例(2%),6/11和1 6/18混合阳性1例(2%). 结论 HPV6/11型感染是湖南地区尖锐湿疣发病的首要原因.感染高峰在年龄40岁以下性活跃人群.
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荧光定量PCR检测手足口病患儿肠道病毒RNA
近年手足口病(hand-foot-mouth disease)在儿童中流行情况较为严重,由肠道病毒感染引起,可经消化道、呼吸道传播,易造成流行[1].主要表现为口腔黏膜溃疡性疱疹及四肢末端水疱样皮疹,主要病原为柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV71)[2].
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细菌16S rRNA基因实时荧光定量及分型方法的建立
目的 细菌培养、组织学、免疫学及普通PCR方法 等在病原菌的检测方面都存在一定的不足,不能满足临床的需要,探索快速可靠的败血症和化脓性脑膜炎等细菌性感染疾病诊断的新方法 是目前亟待解决的关键问题.方法 分析细菌16S rRNA基因序列,在高度保守区自行设计通用引物和探针,以及革兰阳性和阴性分型探针,对12种标准菌株、23种临床培养分离株、乙型肝炎病毒、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA等进行了荧光定量检测,分析三种探针检测结果 的相关性.结果 细菌16S:rRNA基因荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,低能检测到10个拷贝的16s rRNA基因,即相当于2个细菌,与病毒、真菌及人基因组DNA等无交叉阳性反应;12种标准菌株、23种临床培养分离株均进行三种探针的荧光定量检测:通用探针均为阳性,18株革兰阳性菌株通过革兰阳性探针(G+Probe探针)检测为阳性,17株革兰阴性菌株通过革兰阴性探针(G-Probe探针)检测为阳性,反之均为阴性,吻合率100%.结论 建立了用通用引物和分型双荧光探针的细菌荧光定量PCR定量、分型方法 .其检测方便,快速、敏感性和特异性高,符合率好,同时进行定量和分型,在病原菌检测方面具有推广及应用价值.
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实时荧光定量PCR法检测BARF1基因在鼻咽癌中的表达
目的通过检测EB病毒编码的BARF1基因在鼻咽癌组织中的表达水平,探讨BARF1基因与鼻咽癌之间的关系.方法应用实时荧光定量PCR法对BARF1基因在鼻咽癌、头颈部其他恶性肿瘤及慢性鼻咽炎病人组织中的表达进行检测.结果 BARF1基因在鼻咽癌、头颈部其他恶性肿瘤及慢性鼻咽炎组织中的阳性表达率分别为100%、94.4%和80%,三者组间进行比较差异无统计学意义(P>0.05);鼻咽癌组织中BARF1基因的相对表达强度中位数为11.87,头颈部其他恶性肿瘤为0.07,慢性鼻咽炎组织为0.02.BARF1基因在鼻咽癌组织与头颈部其他恶性肿瘤及慢性鼻咽炎组织中的表达强度进行比较,均有统计学意义(P<0.05).结论 BARF1基因在各种组织中存在着普遍的表达,而在鼻咽癌组织中存在着较高的表达强度,提示BARF1基因在鼻咽癌细胞癌变过程中可能发挥重要作用.
关键词： 鼻咽肿瘤/遗传学 荧光定量 爱泼斯坦-巴尔病毒(EB病毒) -
去羟肌苷、司他夫定和奈韦拉平抗人免疫缺陷病毒治疗的初步观察
高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy, HAART)对于艾滋病的治疗和预防具有极为重要的意义,但国内目前仅有齐多夫定、拉米夫定、印地那韦、依非韦伦等规范用药的个别报道,并显示这些药物存在一些缺点.为观察去羟肌苷、司他夫定和奈韦拉平联合治疗人免疫缺陷病毒(HIV)-1感染者的抗病毒效果、免疫重建效果和毒副作用,我们用该三种药物对10例无明显艾滋病症状的HIV-1感染者进行规范的治疗,分别在用药前、用药4周和12周检测其血浆HIV-1 RNA载量(荧光定量PCR法)和外周血CD4+、CD8+淋巴细胞数,并观察和记录用药后的毒副反应和血常规、主要生化指标的变化.
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荧光探针定量PCR检测HBV-DNA临床应用评价
为评价荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法在检测血清中乙型肝炎病毒(HBV)数量及免疫指标的准确性,特对614份临床血清标本进行HBV-DNA测定.现将结果报告如下.
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荧光定量PCR在单疱病毒角膜炎诊断中的应用
单疱病毒性角膜炎是常见的致盲眼病,因潜伏感染,疾病反复发作,临床上单凭病变形态和临床经验诊断已不利于治疗.本文采用聚合酶链反应结合荧光探针的体外DNA扩增和FQ-PCR检测技术对42名临床诊断为病毒性角膜炎病人的45份泪液进行病毒性角膜炎基因诊断,现总结报告如下.
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LightCycler实时监测PCR定量分析血清HBV DNA
目的检验LightCycler实时监测PCR(real-time detection PCR, RTD-PCR)对血清中HBV DNA定量检测的灵敏性和可重复性,探讨HBV血清标志物与HBV DNA定量的关系.方法 HBV定量按深圳匹基公司乙肝PCR荧光检测试剂盒使用说明,对乙肝标志物已明确的773例血清中HBV DNA定量结果进行统计分析.结果实时监测PCR对血清中HBV DNA定量检测的灵敏性高,可检测低至1000拷贝/ml血清;可重复性好,批间误差＜20%;各种标志物类型的血清HBV DNA含量分布情况表明,HBV血清标志物中HBeAg与HBV DNA含量有明显的关系,一般HBeAg阳性血清HBV DNA含量较高,但也有相当一部分例外.结论 LightCycler实时监测PCR对血清中HBV DNA定量检测灵敏性高可重复性好;仅根据HBV血清标志物往往不能确定乙肝患者HBV DNA复制水平的高低,HBV DNA定量检测具有十分重要的临床意义.
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舒筋止痛水治疗肩周炎模型兔对血清中炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2的影响研究
目的:观察舒筋止痛水对肩周炎兔血清中炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2的影响.方法:将12只新西兰兔随机分为空白组(清水治疗)、治疗组(舒筋止痛水治疗)各6只,持续机械劳损加冰敷造模3天后对两组模型兔行血清标本取材,造模成功后治疗组进行舒筋止痛水外用涂擦治疗,空白组则进行清水外用涂擦,14天后分别对两组模型兔进行血清标本取材,采用Tripure提取血清中的RNA,并用逆转录试剂盒对mRNA逆转录为cDNA用于荧光定量分析.结果:造模后,血清中各指标的相对表达量均有所上升,其中IL-1β和COX-2分别为未处理前的5.87倍和7.85倍,且二者与未处理相比差异有统计学意义,而TNF-α仅增加0.8倍,差异无统计学意义:治疗后空白组血清中炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2均未见明显改变,而治疗组血清中炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2均有下降,其中COX-2下调显著,与舒筋止痛水治疗肩周炎兔疗效相符,为佳指标.结论:舒筋止痛水外用治疗肩周炎模型兔,可通过抑制炎症因子IL-1β、COX-2表达进而减轻炎症,具有治疗肩周炎的作用.
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荧光定量PCR法检测结核杆菌效果研究
目的:探讨荧光定量PCR法检测结核杆菌效果.方法:210例肺结核患者的血、尿、痰液标本均进行直接涂片和浓集涂片找抗酸杆菌和结核杆菌培养及FQ-PCR检测,观察3种方法检测不同标本中结核杆菌的阳性率.结果:本组痰标本中FQ-PCR技术检测结核杆菌阳性率为59.5%,高于涂片镜检的30.0%和结核杆菌培养的阳性率(39.1%),后两种与前者方法比较,差异有统计学意义(P<0.05).血和胸水标本中FQ-PCR技术检测结核杆菌阳性率分别为37.6%,36.7%,与其他两种方法比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论:FQ-PCR应与常规细菌学方法互补使用,以提高结核病诊断的准确率.
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正、反义β-1,4半乳糖基转移酶Ⅱ和Ⅴ地高辛标记RNA探针的制备和应用
目的为了探讨β1,4半乳糖基转移酶-Ⅱ和Ⅴ(β1,4-galactosyltransferase I,β-1,4-GalT-Ⅱ and Ⅴ)表达定位,本实验通过分子生物学手段,制备正、反义β-1,4-GalT-Ⅱ和Ⅴ地高辛标记的RNA原位杂交探针.方法设计引物,提取小鼠脑总RNA,通过RT-PCR方法,得到β-1,4-GalT-Ⅱ和Ⅴ基因序列,将其克隆到pGEM-T载体.根据其多克隆酶切位点和Sp6及T7位置,分别酶切后作为转录模板,通过Sp6及T7 RNA聚合酶,得到正、反义β-1,4-GalT-Ⅱ和Ⅴ地高辛标记的RNA原位杂交探针.检测标记探针的效价后,后通过原位杂交分析标记探针的特异性和杂交效果.结果本实验得到了高效价的正、反义β-1,4-GalT-Ⅱ和Ⅴ地高辛标记的RNA原位杂交探针,并表现出很好的杂交效果.结论正、反义β-1,4-GalT-Ⅱ和Ⅴ RNA原位杂交探针的制备,为进一步研究β-1,4-GalT-Ⅱ和Ⅴ在组织中的表达,尤其在神经组织的定位奠定基础.
