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H1受体拮抗剂异丙嗪降低紫杉醇对卵巢癌的化疗作用
目的：观察紫杉醇化疗时为缓解过敏反应而常规联用的组胺H1受体拮抗剂是否影响其疗效。方法：构建荷人卵巢癌裸鼠模型，随机分为对照、单用紫杉醇、单用异丙嗪、异丙嗪＋紫杉醇4组，6．5 mg／kg异丙嗪或生理盐水腹腔注射给药0．5 h后，再予腹腔注射10 mg／kg紫杉醇或生理盐水（每3 d 1次，共4次），测量肿瘤体积和瘤重。免疫组化检测肿瘤血管标志物CD31的表达；MTT法检测卵巢癌细胞株SKOV3和CAOV3的增殖情况；Annexin V／PI流式分析细胞的凋亡情况；荧光定量PCR检测VEGF mRNA的表达。结果：上述4组瘤体体积增加量和瘤重分别为461．52 mm3（0．451 g）、314．66 mm3（0．320 g）、571．81 mm3（0．503 g）和462．47 mm3（0．454 g）。单用异丙嗪组瘤体CD31的表达量高，异丙嗪＋紫杉醇联用组者亦明显多于单用紫杉醇组。异丙嗪对卵巢癌细胞的增殖、VEGF的表达和紫杉醇诱导的凋亡没有影响。结论：卵巢癌化疗时使用H1受体拮抗剂异丙嗪会降低化疗药的效果，机制可能与异丙嗪促进肿瘤血管生成有关。
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巨噬细胞移动抑制因子缺失加重苯肾上腺素诱导的小鼠心肌肥厚
目的：研究巨噬细胞移动抑制因子（ MIF）缺失对皮下注射苯肾上腺素（ PE）诱导的小鼠心肌肥厚的影响。方法：利用MIF敲除（ MIF－KO）小鼠及其野生型对照小鼠，分别建立皮下注射PE诱导的小鼠心肌肥厚模型。小动物心脏B超检测小鼠心脏的结构功能改变。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记（ TUNEL）法检测小鼠心肌细胞凋亡。分别用荧光定量PCR和Western blot方法分别检测SOD1、SOD2和Trx2的表达。结果：连续3 d皮下注射20 mg? kg－1? d－1 PE可诱导小鼠发生心肌肥厚，注射PE诱导MIF－KO小鼠发生心肌肥厚的程度高于野生型对照小鼠。 TUNEL结果显示，注射PE诱导MIF－KO小鼠心肌发生凋亡的程度高于野生型对照小鼠。注射PE诱导MIF－KO小鼠心肌中SOD1和Trx2表达降低，而且MIF－KO小鼠心肌中Trx2水平显著低于野生型对照小鼠。结论：MIF缺失降低SOD1和Trx2表达，进而加重苯肾上腺素诱导的小鼠心肌
细胞凋亡和心肌肥厚。 -
胞红蛋白对巨噬细胞氧化损伤的保护作用
目的：本文探讨巨噬细胞氧化应激过程中胞红蛋白（ CYGB）表达模式；研究CYGB在巨噬细胞氧化应激过程中的作用。方法：（1）Western blot检测RAW264．7细胞在H2O2刺激不同时间CYGB的蛋白表达水平；检测RAW264．7细胞在不同浓度H2 O2刺激12 h时CYGB蛋白的表达水平。（2）构建CYGB过表达／低表达巨噬细胞模型，将RAW264．7细胞分为4组：对照组、0．5 mmol／L H2 O2处理组、0．5 mmol／L H2 O2＋CYGB过表达组及0．5 mmol／L H2 O2＋CYGB低表达组。12 h后，检测CYGB蛋白水平、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）；荧光定量PCR检测CYGB和NF－κB在细胞中的表达。结果：（1）Western blot结果显示：H2O2处理6、12和24 h组CYGB表达水平高于对照组，并且在12 h组CYGB表达水平高，差异有统计学意义（ P＜0．05）。0．25 mmol／L H2 O2、0．5 mmol／L H2 O2和1 mmol／H2O2处理巨噬细胞12 h后CYGB表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0．05）。（2）Western blot结果显示：0．5 mmol／L H2 O2处理组、0．5 mmol／L H2 O2＋CYGB过表达组及0．5 mmol／L H2 O2＋CYGB低表达组CYGB蛋白表达水平均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0．05）。0．5 mmol／L H2O2＋CYGB过表达组的CYGB表达高（P＜0．05），0．5 mmol／L H2 O2＋CYGB低表达组的CYGB表达较0．5 mmol／L H2 O2处理组低，差异有统计学意义（ P＜0．05）。酶联免疫吸附测定法（ELISA）和ROS检测结果显示：与0．5 mmol／L H2O2相比，0．5 mmol／L H2O2＋CYGB过表达组中GSH－Px、SOD升高，LDH、MDA和ROS下降；与0．5 mmol／L H2 O2组相比，0．5 mmol／L H2 O2＋CYGB低表达组中GSH－Px和SOD下降，LDH、 MDA和ROS升高。荧光定量PCR检测显示：与正常对照组比较，H2 O2处理组CYGB和NF－κB表达均上调（ P＜0．05）。与H2 O2对照组比较，CYGB过表达组CYGB表达较高，NF－κB表达较低（P＜0．05）；CYGB低表达组CYGB表达较低，NF－κB表达较高（P＜0．05）。结论：CYGB在巨噬细胞中表达，在H2 O2刺激时表达水平增加；CYGB在巨噬细胞氧化应激损伤过程中具有细胞保护作用。
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发热患儿EB病毒检测及感染状况分析
目的 了解和分析EB病毒在儿科发热患者中的感染情况及临床表现特点.方法 采用实时荧光定量PCR法对儿科发热患者的淋巴细胞进行EB病毒检测.结果 在3429例感染患儿中检出EB病毒阳性738例,阳性率为21.52％;在EB病毒感染的发热病例中,伴有典型临床表现占76.15％,其中上呼吸道感染占46.89％、肺炎占16.67％、支气管炎占12.59％.结论 荧光定量PCR方法对EB病毒感染的检测具有早期、快速等优点.
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荧光定量PCR检测UCA1mRNA方法学建立及临床评估
目的 建立荧光定量体外检测UCA1 mRNA的实验方法.方法 用已构建的pcDNA3.1/UCA1重组质粒作为标准品,建立实时荧光定量PCR检测尿液、血液标本UCA1 mRNA的方法,并进行方法学评价.应用此方法检测24例膀胱癌组、30例泌尿系统非膀胱癌组(包括肾癌、前列腺癌)以及20例健康对照组的尿液和血液中UCA1 mRNA的表达,并进行临床评估.结果 膀胱癌患者血、尿标本的阳性符合率分别为91.67％和87.50％,而泌尿系统非膀胱癌患者血、尿标本的阳性符合率为63.33％和66.67％,10份消化系统肿瘤(肝癌、胃癌、食管癌、直肠癌)患者全血标本、10份肺癌患者的全血标本、20份健康人标本全血和尿液标本均为阴性.膀胱癌组阳性率高于其它系统肿瘤和健康对照组(P＜0.01).在膀胱癌组中,UCA1 mRNA的表达与临床分期和病理分级有显著的相关性(P＜0.05).结论 本研究成功建立了可用生物体液(如血液、尿液等)检测UCA1mRNA的技术.
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呼吸道合胞病毒实时荧光RT-PCR定量检测方法的建立
PFU/mL,重复性Ct值的变异系数均小于5%. 结论 本研究建立的实时荧光RT-PCR定量检测方法可靠、准确、简便、稳定.
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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株荧光定量PCR检测方法的建立
目的 应用荧光定量PCR技术实现高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的快速鉴定. 方法 利用所报道的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株Nsp2基因片段设计引物和探针,并对该方法 进行特异度、灵敏度、重复性等方面的考察. 结果 用该方法 检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的近源种未发生非特异性扩增,低检出浓度为1.0×103copy/mL. 结论 用该荧光定量PCR检测方法 检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株不仅特异度好、灵敏度高,且快速简便.
关键词： 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株 荧光定量 PCR -
华中科技大学同济医学院附属同济医院高血压研究所暨基因诊断中心
华中科技大学同济医学院附属同济医院高血压研究所暨基因诊断中心位于湖北省武汉市解放大道1095号，以华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科为主体，系1998年美国Vanderbilt大学学成归国的汪道文教授创立，已建成国内一流的分子生物学实验室，与国外相应的实验室条件相当。该中心现有专职研究人员3人，博士及硕士生36人。实验室面积约为500平方米，拥有完备的分子及细胞生物学实验设备，能在实验室内完成而且常规进行基因克隆、Northern、Southern、Western Blots、基因测序、载体构建、病毒包装、转基因等实验，还建立了完善的遗传学研究平台，包括遗传分析仪（ABI 3130xl），高通量荧光定量PCR仪（ABI 7900HT）和定量遗传分析仪（Qiagen PyroMark Q24）。
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结直肠癌MTAP基因的表达及启动子去甲基化的研究
背景与目的:研究报道甲硫腺苷磷酸化酶(5'-methylthioadenosine phosphorylase,MTAP)在多种肿瘤组织中出现异常表达.本研究检测MTAP基因在结直肠腺癌、结直肠腺瘤和正常结直肠粘膜组织中的表达以及MTAP启动子甲基化的改变,探讨结直肠癌MTAP基因表达的变化与启动子去甲基化的关系.方法:定量PCR检测50例结直肠癌及癌周正常组织中MTAP mRNA的表达量;免疫组织化学的方法检测MTAP在结直肠癌中的表达;甲基化特异多聚酶链反应(Metllylation-specified PCR,MsP)检测正常肠粘膜和结直肠癌组织中MTAP基因启动子发生甲基化的情况.结果:定量PCR结果显示:正常结直肠组织中MTAP mRNA的相对水平显著低于结直肠癌组织(P<0.01);免疫组织化学结果显示MTAP在结直肠腺癌中的表达高于结直肠腺瘤及正常结直肠粘膜(98.00%vs.85.00%和12.50%,P<0.05),结直肠腺瘤与正常结直肠粘膜差异亦具有统计学意义(P
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耐药性癫癎患者脑组织线粒体mMDH NDUFC2基因表达异常
目的研究耐药性癫癎患者脑细胞线粒体mMDH、NDUFC2表达,探讨其在耐药性癫癎形成中的作用.方法分别提取48例耐药性癫癎患者、8例非耐药性癫癎患者及8例对照组脑组织标本的总RNA后,用基因芯片对其进行扫描,随后用荧光定量PCR技术进行验证.结果发现与线粒体功能有关的基因mMDH、NDUFC2在耐药性癫癎中显著下调,荧光定量RT-PCR验证结果与基因芯片一致.结论脑细胞线粒体基因mMDH、NDUFC2表达异常可能通过能量代谢及神经元坏死参与了耐药性癫癎的形成.
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荧光定量逆转录聚合酶链反应检测脑星形细胞瘤中多药耐药基因
目的探讨用荧光定量聚合酶链反应方法检测脑星形细胞瘤中多药耐药(multidrug resistance, MDR1)基因的表达.方法在逆转录聚合酶链反应的基础上,采用荧光定量方法对经病理证实的38例星形细胞瘤进行实时检测MDR1基因,并进行统计学分析.结果复发病人MDR1基因阳性率为88.9%,比初发病人(48.3%)高,Ⅰ级星形细胞瘤病人MDR1基因阳性率为22.2%,Ⅱ级病人为66.7%,Ⅲ级病人为71.4%.结论星形细胞瘤中MDR1基因的阳性率较高,且有原发耐药现象.荧光定量实时检测MDR1基因的方法具有较高的准确度和灵敏度,假阳性率低.
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中国精神病人外周血博尔纳病病毒RNA的检测
博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)是一种非分段的、负链、单股的RNA病毒.具有很强的嗜神经性,能感染从鸟到灵长类的广泛动物种类并引起以中枢神经系统功能障碍为特征的博尔纳病(Boma disease,BD).目前我国大陆尚无国人BDV感染的研究报道.我们采用套式(nested)RT-PCR结合荧光定量(FQ)PCR检测精神病人外周血单个核细胞(PBMC)中BDV P24基因片段.
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SYBR荧光实时定量PCR检测肝移植受者CD95和CD95L mRNA表达
目的检测肝移植受者外周血淋巴细胞CD95和CD95LmRNA的表达,并探讨其在移植肝急性排斥反应中的意义.方法采用SYBR荧光实时定量PCR法检测56例肝移植受者外周血淋巴细胞CD95和CD95LmRNA的表达.结果CD95和CD95L mRNA在移植肝急性排斥患者外周血中的表达均显著升高(P＜0.01),时间上平均早于血肝功能酶谷丙转氨酶、谷草转氨酶升高2 d.结论CD95和CD95L与移植肝急性排斥反应密切相关,CD95和CD95L mRNA可作为移植肝急性排斥反应发生的预测和诊断指标之一.
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Wilms瘤基因WT1 mRNA的FQ-RT-PCR定量分析研究
[目的]探讨WT1mRNA在Wilms瘤表达的临床意义及其与Wilms瘤生物学性状的关系.[方法]对22例Wilms瘤、瘤旁肾组织及血液标本行WT1 mRNA FQ-RT-PCR定量检测.用SPSS软件进行统计学检验,分析.[结果]肿瘤组织中WT1mRNA表达显著高于肾组织和血液,与年龄、性别、BWT或UWT无关.UH型高于FH型,而肾组织表达又较血液高,BWT血中WT1mRNA表达高于正常对照组及UWT组,而UWT与正常表达无差别.[结论]Wilms瘤基因WT1mRNA表达与Wilms瘤发生发展存在关联,且与肿瘤的病理及预后相关,表达越高病理类型及预后越差,但与WT患儿的年龄、性别、BWT或UWT无关.血WT1mRNA表达水平可能作为BWT的诊断或高危筛选指标.
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miR-21和程序性细胞死亡基因4在食管鳞癌中的表达及意义
目的 探讨miR-21和程序性细胞死亡基因4(PDCD4) mRNA在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中的表达及意义.方法 用荧光定量PCR技术检测76例ESCC组织及其对应的正常食管黏膜组织中的miR-21、PDCD4 mRNA的表达量.结果 ESCC组织中miR-21的表达较正常食管黏膜组织中的表达量升高(P＜0.05),PDCD4 mRNA的表达较正常食管黏膜组织中的表达量降低(P ＜0.05);miR-21、PDCD4 mRNA在ESCC组织中的表达与肿瘤浸润深度、TNM分期及淋巴结转移显著相关(P＜0.05),与性别、年龄无关(P＞0.05);ESCC中miR-21、PDCD4 mRNA表达呈负相关(rs=-1.131,P=0.004).结论 miR-21表达升高、PDCD4表达降低在ESCC的发展、侵袭、转移中起一定的作用.
关键词： miR-21 程序性细胞死亡基因4 食管鳞癌 荧光定量 -
荧光定量RT-PCR在检测流感病毒中的应用
流感病毒(influenza virus)是一类具有高度传染性的呼吸道病毒,是线状单股负链RNA病毒,根据核蛋白和基质蛋白的抗原性,流感病毒可以分为甲(A)、乙(B)、丙(C)3种类型.甲型流感病毒基因经常发生突变,造成不同程度的季节性流感流行和流感大流行[1].
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荧光定量PCR检测微小残留病变在急性淋巴细胞白血病的临床应用
在儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)中对微小残留病变(minimal residence disease, MRD)的定量检测可用于预示临床结果.目前对于T-细胞抗原受体(TCR)G基因重排作为靶的适用性研究报告较多,多采用适时-PCR技术作定量分析,以确定MRD的量[1,2].因为,大家都认为MRD量的多少,直接与诱导治疗后的复发有关,如果能对域上含量患者强化治疗,可改善部分患者的预后.
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微小RNA-182在非小细胞肺癌患者血清中的表达及临床意义
目的：探讨微小RNA-182（miR-182）在非小细胞肺癌（NSCLC）患者血清中的表达及其临床意义。方法：收集70例NSCLC患者、40例肺部良性疾病患者、40名健康体检人群作为研究对象。采用实时荧光定量RT-PCR检测血清miR-182的相对表达量，分析NSCLC组miR-182与临床病理资料之间的关系，并依据NSCLC患者和两对照组血清miR-182的相对表达量，利用ROC曲线评价其在NSCLC诊断上的灵敏度和特异度。结果：NSCLC组miR-182血清水平显著高于健康对照组和肺部良性疾病组（均P ＜0．01），肺部良性疾病组与健康对照组差异无统计学意义（P ＝0．13）。 NSCLC组血清miR-182相对表达量与患者年龄、性别、肿瘤大小、病理类型无关（均P ＞0．05），肿瘤晚期（Ⅲ～Ⅳ期）高于肿瘤早期（Ⅰ～Ⅱ期）（P ＜0．01）。ROC曲线下面积为0．784（95％CI：0．707～0．861），当临界值取1．97时，其灵敏度为0．723，特异度为0．803。结论：NSCLC患者血清miR-182水平显著升高，提示可能是NSCLC早期诊断的潜在肿瘤标志物之一。
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荧光定量聚合酶链反应检测人类乳头瘤病毒在尖锐湿疣中的应用
目的:对尖锐湿疣( CA)患者进行人类乳头瘤病毒( HPV) DNA定量测定及 HPV分型.方法:用荧光定量聚合酶链反应( FQ- PCR)对 146例 CA患者疣体组织进行 HPV 6.11型和 HPV 16.18型的分型检测及 HPV DNA定量测定.结果: 146例 CA患者标本中检出 HPV 6.11和 HPV 16.18型感染阳性 143例( 97.95%).其中单独 HPV 6.11型阳性 104例,占 71.24%;单独 HPV 16.18型阳性 16例,占 10.96%; HPV 6.11和 HPV 16.18型同时阳性 23例,占 15.75%; HPV 6.11和 HPV 16.18型同时阴性 3例,占 2.05%.定量测定结果显示: HPV 6.11型患者病毒载量高 1.0× 108拷贝 /mL,低 2.8× 103拷贝 /mL, HPV 16.18型患者病毒载量高 1.0× 108拷贝 /mL,低 2.57× 104拷贝 /mL.结论: CA患者应用 FQ- PCR检测 HPV阳性率高,并可快速区分高危型及低危型 HPV感染,对尖锐湿疣复发及癌变作出可能性预测.
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荧光定量PCR在手部非结核分枝杆菌感染中的应用进展
非结核分枝杆菌（NTM）是指除结核分枝杆菌复合群（MTC）及麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。 NTM通常属于机会致病菌，目前已发现的NTM有154种［1］。在一些国家和地区，NTM的发病率和患病率呈逐年升高趋势，甚至可能超过结核病［2］。 NTM 引起人类疾病通常为继发性的，在 AIDS 和免疫受损患者中，NTM 病常表现为播散性［3］。NTM主要引起肺部的病变，当前研究［4］显示手部NTM的感染率正在逐年递增，其感染菌主要为：海、鸟、堪萨斯、偶发、龟、脓肿分枝杆菌等共18种［5］。手部 NTM感染如不及时诊断和治疗，可引起手部不同程度功能障碍，且不同种类NTM引起的感染其治疗方案不同［6］，所以明确NTM感染及区分病原菌种类显得尤为重要。
