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影响人乳头瘤病毒相关细胞系增殖的因素
人乳头瘤病毒的基因表达与KC的增殖分化相互影响.近二十年来人们在如何体外重复两者之间的关系方面做了大量工作,但由于体外培养人乳头瘤病毒非常困难,因此有关实验多是采用体外培养的人乳头瘤病毒相关肿瘤细胞系作为研究对象.本文的内容包括(1)HPV相关细胞系体外培养的方法;(2)有关影响人乳头瘤病毒相关细胞系增殖的细胞因子和药物,及其作用机理.
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1-07 镍化合物诱发细胞恶变过程中P53基因突变
目的探讨3种镍化合物在诱发细胞恶变过程中不同阶段P53基因突变情况,并比较它们之间的差异.方法 3种镍化合物转化细胞接种BALB/c裸鼠,应用PCR-SSCP法进行肿瘤细胞和转化细胞P53基因第5～8外显子检测.结果硫化镍、氯化镍、硫酸镍分别诱发的转化细胞都在BALB/c裸鼠皮下形成肿瘤,病理组织学检查确定为纤维肉瘤.硫化镍组1个经软琼脂筛选的转化细胞系和相应的肿瘤细胞系P53基因第8外显子检出突变.氯化镍组的肿瘤细胞系第6外显子检出突变.结论 3种镍化合物所诱发的细胞转化为恶性转化,且都具有体内致瘤性.镍化合物诱发细胞恶变的晚期发生P53基因突变.
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Survivin特异小干扰RNA表达载体构建及对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响
目的 测定Survivin特异小干扰RNA(siRRA)表达载体对肺腺癌细胞A549 Survivin基因表达的抑制及对增殖和凋亡的影响.方法 构建Survivin特异性小干扰RNA表达载体,转染A549细胞,筛选出稳定表达的细胞株.用荧光实时定量反转录聚合酶链反应法、Western blot和免疫组化法检测Survivin基因mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果 经测序鉴定证实成功构建Survivin-siRRA表达载体.Survivin基因mRNA表达量下降76.4%,Western blot显示蛋白表达下降84.5%,免疫组化法也显示Survivin蛋白表达下降.MTT法测定细胞增殖较对照组减慢(P＜0.01),细胞凋亡率较对照组增加8.95%(P＜0.01).结论 Survivin特异siRRA表达载体下调Survivin基因表达,抑制A549细胞的增殖,促进凋亡.
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抗菌肽P18抑制喉癌细胞Hep-2增殖
抗菌肽能广谱杀伤包括耐药菌株在内的细菌、某些真菌、寄生虫、部分病毒以及肿瘤细胞,具有微量高效、快速、广谱的特点.抗菌肽P18是天蚕素A和爪蟾素2通过连接和替换某些氨基酸设计出的抗菌肽P18[1],其有更强的抗菌活性,并且对K562、Jurkat等多种肿瘤细胞系有抗癌效果,同时不会诱导溶血.而有关抗菌肽P18对喉癌方面的研究国内外报道较少,本研究成功构建真核表达载体,表达出融合蛋白对于Hep-2细胞增殖具有一定抑制作用,这为其后续作用机制的研究提供了依据.
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1,25-二羟维生素D3及其类似物对MCP-1与树突状细胞间相互作用的影响
1,25-二羟维生素D3(骨化三醇),具有免疫调节功能并能通过促进细胞分化、抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,从而对血液系统或其他组织来源的多种肿瘤细胞系发挥很强的抑制效应.已发现肿瘤组织内或组织旁浸润的树突状细胞(DC),数量越多预后越好.单核细胞分泌的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是单核细胞的趋化和激活因子,具有抗肿瘤效应.
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外吐小体在变应性疾病发病机制中的作用
外吐小体( exosome, EXO)为磷脂膜包被的大小为20~100 nm的内吞囊泡,可由培养后的大多数细胞分泌产生。Trams等[1]1981年初将其描述为肿瘤细胞系分泌的具有5′-核苷酸活性的微囊泡。随后,Pan等[2]的研究发现培养后的网织红细胞多囊内吞体中存在外吐小体,内含转铁蛋白受体--参与细胞内吞作用及回收细胞表面蛋白质。通过电镜观察发现,含有外吐小体的多囊内吞体通过膜融合将细胞内的物质释放至细胞外,继而,多囊内吞体与细胞膜的融合并向细胞外释放外吐小体的现象在几乎所有的细胞类型中发现,例如,细胞毒性 T 细胞、B 细胞、肥大细胞、树突状细胞、血小板、肿瘤细胞、上皮细胞[3]。 EXO广泛参与体内的免疫应答过程,与多种疾病的发生、发展密切相关。本文将对EXO的生物学特性及其在变态反应性疾病发病机制中的作用进行综述。
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人胰腺癌细胞株PANC1裸鼠原位模型的建立及磁共振监测
目的 建立一种稳定的人胰腺癌裸小鼠原位移植瘤模型,并探讨无创的磁共振(MRI)对其监测的应用价值.方法 人胰腺癌细胞株PANC1体外常规传代后建立裸鼠皮下种植瘤模型,将皮下种植瘤制成细胞悬液,植入20只BALB/C-nn裸鼠的胰腺包膜下构建人胰腺癌原位移植模型;通过MRI检查监测模型的成瘤率、成瘤时间、肿瘤生长速度、肿瘤形态、信号变化等特征,于第7周末取肿瘤组织行病理学检查.结果 接种后15 d,7只(35%)荷瘤鼠在MRI上显示成瘤,至接种后27 d,成瘤率为100%.肿瘤信号与邻近组织相比,90%(18/20)病灶T1WI呈均匀稍低信号,10%(2/20)呈等信号;75%(15/20)在T2WI呈均匀高信号.移植后2、3、4、5、6、7周经MRI测量的移植瘤体积分别为(12.6±2.4)mm3、(94.3±11.2)mm3、(175.9±82.5)mm3、(395.8±126.6)mm3、(1290.2±167.2)mm3、(1583.4±87.4)mm3.病理学检查确诊为胰腺低分化腺癌,并保持原发瘤的生物学特征.结论 人胰腺癌细胞株PANC1移植瘤制成的细胞悬液种植裸小鼠胰腺包膜下制备胰腺癌模型符合人胰腺癌的特征,且易于无创监测,为临床研究提供了一个有效、稳定的体内实验体系.
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放化疗抵抗的胰腺癌细胞中干细胞标志物的表达
目的 观察放化疗抵抗的胰腺癌细胞的Bcl-2、survivin及干细胞标志物Oct-4、ABCG2蛋白表达的变化,探讨这部分肿瘤细胞耐受放化疗的原因.方法 采用同步放化疗干预人胰腺癌细胞系SW1990、BxPC3、pc3、jr305,获得放化疗抵抗的胰腺癌细胞,以不行放化疗处理的细胞作为对照.采用Western blotting检测它们的Bcl-2、survivin、Oct-4和ABCG2蛋白的表达变化.结果 放化疗抵抗的SW1990、BxPC3、pc3、jt305胰腺癌细胞Bcl-2蛋白表达量分别为0.7955±0.0326、0.5718±0.0212、0.6137±0.0382和0.8733±0.0461;survivin蛋白表达量分别为0.8207±0.0490、0.6973±0.021 1、0.7967±0.0346和0.8013±0.0398;Oct-4蛋白表达量分别为0.8728±0.0177、0.7861±0.0139、0.4794±0.0932和0.4216±0.1043;ABCG2蛋白表达量分别为0.7810±0.1370、0.4957±0.1126、0.6102±0.1358和0.4670±0.1274.对照组相应细胞系的4种蛋白表达量分别为0.4723±0.018、0.2954±0.0103、0.3587±0.0201和0.2718±0.0136;0.4717±0.0274、0.3587±0.0113、0.3891±0.0147和0.3326±0.0124;0.6053±0.0142、0.4236±0.0086、0.2385±0.0671和0.1985±0.0582;0.3156±0.0582、0.2360±0.0423、0.2813±0.0512和0.1808±0.0370.放化疗后胰腺癌细胞的4种蛋白表达量均显著增加(P＜0.05).结论 放化疗抵抗的胰腺癌细胞中可能富含肿瘤干细胞.
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功能性β1整合素-GFP融合蛋白稳定过表达肝癌细胞系的建立
目的 建立β1整合素-绿色荧光蛋白(GFP)稳定过表达人肝癌细胞系并检测其对各基质蛋白的黏附能力.方法 构建β1整合素-GFP融合蛋白真核细胞重组表达质粒,并将其转染至人肝癌Hep3B细胞,建立稳定过表达β1整合素的肝癌细胞系.利用RT-PCR,Western印记,免疫沉降和荧光显微镜观察融合基因;检测转染细胞的增殖情况及对各基质蛋白的黏附能力.结果 获得β1整合素-GFP融合蛋白稳定转染过表达Hep3B细胞系;转染的β1整合素能与内因性α1,α5,α6整合素亚型形成二聚体;转染β1整合素对细胞增殖无明显影响,但使细胞对各基质蛋白的黏附能力明显增高.结论 建立了功能性β1整合素-GFP稳定过表达的人肝癌细胞系,为进一步研究β1整合素基因的功能提供了一个有效的细胞系.
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妇科恶性肿瘤序贯化疗研究进展
化疗是妇科恶性肿瘤重要的辅助治疗,不同化疗药物如何合理应用即治疗模式的探索成为研究热点.序贯化疗是根据Norton-Simon假说,将非交叉耐药的药物序贯应用,具体的给药方式是先应用几个周期适剂量药物A后再给予几个周期适剂量药物B的化疗方式,其中药物A和药物B可以是单药也可以是既定的联合方案,旨在针对不同化疗敏感图谱的肿瘤提高化疗效果,减轻毒副反应[1].肿瘤细胞存在异质性,即同一肿瘤内部由于肿瘤细胞系不同而造成的肿瘤细胞的差异[2].序贯化疗可根据肿瘤发生发展的不同生物学特点及异源性制定相应的治疗方案,治疗效果较传统的治疗方法有提高.
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子宫颈癌癌前病变和早期子宫颈鳞癌组织中血小板源性生长因子的表达及其临床意义
肿瘤组织的新生血管和新生淋巴管发生受许多因素的调控,其中血小板源性生长因子(platelet-derived growthfactor,PDGF)家族成员及其受体在肿瘤组织新生血管及淋巴管的发生过程中发挥着重要作用;PDGF-A和PDGF-B在宫颈癌细胞中有表达[1].研究表明,宫颈癌组织中存在PDGF受体(PDGFR)的表达,被认为是潜在的抑癌位点[2].动物实验发现,PDGF-A、B均能促进肿瘤淋巴管的新生,其中PDGF-B对淋巴管新生具有较强的作用[3];PDGF-A可以促进非小细胞肺癌的血管新生[4].PDGF-C、D是近年来发现的PDGF家族新成员,在多种肿瘤细胞系中有表达,PDGF C具有促进血管新生的作用[5-6],然而,两者在人类疾病中的作用机制有待深入研究.本研究旨在定量检测宫颈病变组织中的PDGF-A、B、C、D基因的表达水平,并探讨其与淋巴管内皮标志物——同源框转录因子Prox-1代表的微淋巴管新生之间的关系.
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妇科肿瘤细胞系中p73等位基因表达的研究
基因组印迹(genomic imprinting) 是指来自亲代的两个等位基因在子代中存在亲代性别特异性差异表达的现象.近年来的研究表明,基因组印迹现象不仅与一些遗传疾病的发生有关,而且,与肿瘤的发生与发展密切相关[1].p73基因是新近发现的p53基因家族成员.有关p73基因在妇科肿瘤中表达的研究尚未见报道.本研究测定了妇科肿瘤细胞系中p73等位基因的表达,以揭示p73基因在这些肿瘤发生发展中的作用.
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抑制PI3K/Akt提高药物对HeLa细胞放射增敏作用的研究
目的 通过研究抑制I3K/Akt提高多烯紫杉醇和顺铂对HeLa细胞放射增敏作用,探讨PI3K/Akt在多烯紫杉醇和顺铂放射增敏中的机制.方法 体外培养HeLa细胞,应用MTT测定多烯紫杉醇和顺铂对HeLa细胞半数抑制率(IC50).应用药物(IC20)单独及联合LY294002作用24 h后X线2、3、4、6、8 Gy照射.计算细胞克隆存活分数,多靶单击模型拟合曲线并计算Dq、D0、SF2值和放射增敏比(SER).应用western blot方法检测Akt和磷酸化Akt蛋白的表达.应用流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 多烯紫杉醇和顺铂能够明显提高放射引起的Akt磷酸化.多烯紫杉醇+LY294002+放射组、顺铂+LY294002+放射组SER(1.92、1.71)明显高于多烯紫杉醇+放射组、顺铂+放射组(1.41、1.37).多烯紫杉醇+LY294002+放射组、顺铂+LY294002+放射组细胞凋亡率(12.5%、10.2%)明显高于多烯紫杉醇+放射组、顺铂+放射组(6.1%、5.1%).结论 PI3K/Akt信号转导途径的活化是多烯紫杉醇和顺铂对HeLa细胞放射增敏作用降低的重要原因,抑制PI3K/Akt能够提高多烯紫杉醇和顺铂对HeLa细胞的放射增敏作用.
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人肿瘤细胞系LigaseⅣ基因突变与放射敏感性的关系研究
目的研究人肿瘤细胞DNA-LigaseⅣ基因突变与放射敏感性的关系.方法常规集落形成方法测定人鼻咽鳞癌(CNE)、肺腺癌(SPC-A1)和乳腺腺癌(MCF-7)细胞系不同剂量照射后的细胞存活分数,采用聚合酶链式反应和克隆技术测定3种细胞参与DNA损伤修复的DNA ligaseⅣ基因序列,分析它们的同源性变化和突变对基因产物亲疏水性的影响.结果 3种细胞存活参数比较存在较大差异,CNE细胞较SPC-A1和MCF-7细胞显示出较高的放射敏感性.CNE、SPC-A1和MCF-7细胞LigaseⅣ基因同源性分别为99.95%、99.99%和99.98%,包括碱基转换和颠换突变.部分突变碱基导致氨基酸替代并影响基因产物的亲疏水结构.CNE细胞LigaseⅣp的313aa His→Arg、538aa Gly→Arg、579aa Lys→Arg和585aa Asn→Ser替代与CNE细胞放射敏感性高于SPC-A1和MCF-7细胞有关.结论 LigaseⅣp在非同源性末端连接(NHEJ)途径中起关键和终连接作用,该基因突变影响肿瘤细胞的双链断裂损伤修复能力和放射敏感性.
关键词： 放射敏感性 脱氧核糖核酸连接酶Ⅳ 肿瘤细胞系 人 -
塞来昔布对不同COX-2表达肿瘤细胞株放射增敏作用及其机制研究
目的 探讨选择性环氧化酶抑制剂塞来昔布对不同COX-2蛋白表达水平人类肿瘤细胞株的放射增敏作用及其发生机制.方法 选用人乳腺癌细胞系MCF-7(低COX-2蛋白表达)和肺癌细胞系A549(高COX-2蛋白表达)为研究对象.RT-PCR检测COX-2表达,MTT法及成克隆分析法测定塞来昔布对两种细胞系的细胞毒作用及放射增敏作用及流式细胞仪(FCM)检测细胞周期分布、细胞凋亡指数.结果 塞来昔布作用于MCF-7细胞30 h后的IC50值为(43.7±1.12)μmol/L,作用于A549细胞24h后的IC50值为(37.5±0.80)μmol/L.塞来昔布联合射线作用于A549细胞,与单纯照射组比较显示了放射增敏作用(P＜0.05),而在MCF-7细胞中则没有观察到这些现象.细胞周期检测发现,两种细胞各组都出现了不同的周期分布.塞来昔布组G0+G1期细胞比例增加,照射组的细胞则大多处于G2+M期.不同浓度的塞来昔布10～80 μmol/L作用6 h后,均未观察到明显的凋亡现象,两种细胞照射组与照射加药组测得的凋亡均无差异.结论 塞来昔布对MCF-7、A549细胞都有增殖抑制作用,并呈时间和剂量依赖性,其作用不完全呈COX-2依赖.塞来昔布能增加A549细胞放射敏感性,其机制可能与抑制COX-2蛋白、改变细胞周期分布有关.
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"彗星"分析法检测人癌裸鼠移植瘤的放射敏感性
目的探讨"彗星"分析法应用于人实体肿瘤放射敏感性检测的可能性.方法应用"彗星"分析法,以尾力距之比(RTM)作为终指标,检测人肺腺癌、人食管鳞癌和人鼻咽鳞癌等3种人癌裸小鼠移植瘤的放射敏感性.裸小鼠移植瘤组织被消化并稀释成细胞浓度为4×104ml的单细胞悬液后,分成对照组(0Gy)和不同剂量照射组,照射组分别给予2、5、10和15Gy的6MVX射线的冰上照射,照射后立即进行"彗星"分析.结果3种人癌裸小鼠移植瘤细胞未照射时(0Gy)的尾力矩(TM)差异有显著性意义(F=9.11,P＜0.01).不同剂量(2、5、10和15Gy)照射后,3种人癌裸小鼠移植瘤细胞未做校正时的TM所反映放射敏感性由高到低的变化趋势依次为:肺腺癌＞食管鳞癌＞鼻咽鳞癌,显然与临床一般印象不符;而经与对照组进行"本底"校正后的RTM所反映放射敏感性由高到低的变化趋势依次为:食管鳞癌＞鼻咽鳞癌＞肺腺癌,则符合临床一般印象.结论①应用"彗星"分析法检测实体肿瘤的放射敏感性,尾力矩必须进行"本底"校正,即扣除对照组本底误差后的尾力矩才能很好地反映实体肿瘤的放射敏感性差异.②"彗星"分析法可用于检测人体肿瘤组织的放射敏感性.
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抗菌肽LL-37在巨噬细胞促卵巢癌细胞增殖中的作用
目的 研究抗菌肽LL-37在巨噬细胞促进卵巢癌细胞增殖中的重要作用.方法 采用Transwell(R)插入式细胞培养皿共培养人巨噬细胞和卵巢癌细胞株SKOV3、3AO和HO-8910.采用溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)-酶联免疫吸附试验(ELISA)法和细胞计数法检测巨噬细胞对卵巢癌细胞增殖能力的影响.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测巨噬细胞和SKOV3细胞中LL-37 mRNA和蛋白的表达.应用LL-37中和抗体抑制LL-37的功能活性,观察LL-37在巨噬细胞促进卵巢癌细胞增殖中的作用.结果 细胞计数法检测结果显示,SKOV3细胞与巨噬细胞以1∶0.5的比例共培养4d后,SKOV3细胞的数量从(6.0±0.5) ×104个增加为(11.8±1.3) ×104个,差异有统计学意义(P＜0.05),并且随着共培养的巨噬细胞比例的增加,SKOV3细胞的数量也随之升高(P＜0.05).与巨噬细胞共培养后,3AO和HO-8910细胞的数量变化趋势与SKOV3细胞相似.BrdU-ELISA法检测的结果与细胞计数法一致.RT-PCR和Western blot法检测结果显示,在与卵巢癌SKOV3细胞共培养后,巨噬细胞中LL-37 mRNA和蛋白的表达均上调,且随着时间的延长其表达增加,但其在SKOV3细胞中的表达并未增强.BrdU-ELISA法检测的结果显示,经LL-37处理后,HO-8910和3AO细胞的增殖能力明显增加；但加入LL-37中和抗体后,可明显抑制巨噬细胞对SKOV3、3AO和HO-8910细胞的增殖促进作用,这3株细胞的吸光度分别从2.95 ±0.11降至1.45 ±0.04,3.39±0.36降至1.32±0.09,3.93 ±0.17降至1.68±0.23(均P＜0.05).结论 在与卵巢癌细胞相互作用的条件下,巨噬细胞通过增强抗菌肽LL-37的表达和分泌促进了卵巢癌细胞的增殖.LL-37在巨噬细胞促进卵巢癌的发展中扮演重要角色.
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射线联合嵌合启动子介导的自杀基因对肿瘤细胞的靶向杀伤作用
目的 探讨放射线联合新型嵌合启动子介导辣根过氧化物酶/吲哚乙酸(HRP/IAA)自杀基因系统特异高效的抗肿瘤作用.方法 构建含有4个串联放射反应元件CArG、含或不含巨细胞病毒(CMV)启动子的人端粒酶逆转录酶嵌合启动子,筛选肿瘤特异性及放射诱导性强的嵌合启动子,下游连接自杀基因辣根过氧化物酶(HRP),检测放射线联合基因治疗对肿瘤细胞HeLa、A549和MHCC97增殖及凋亡的影响.结果 人胚肺成纤维细胞MRC-5中C4-hTC嵌合启动子的活性(0.1±0.0)明显低于肿瘤细胞株HeLa、A549和MHCC97(0.6±0.0、1.1±0.1和1.0±0.1,P＜0.01),经过6 Gy射线诱导后,这种差异更加显著(活性分别为0.2±0.1、1.7±0.2、2.3±0.2和2.3±0.1,P＜0.01).在肿瘤细胞株HeLa、A549和MHCC97中,嵌合启动子C4-hTC-HRP携带的自杀基因系统SER值分别为2.64、2.75和2.82,显著高于单纯hTERT启动子.在肿瘤细胞中,除阴性对照质粒pGL3-control-Luc外,自杀基因与放射治疗相联合对肿瘤细胞的生长抑制明显高于单一治疗方法,而联合组中pC4-hTC-HRP/IAA系统与放射联合的生长抑制作用显著,对HeLa、A549和MHCC97细胞的生长抑制率分别为67.3%、69.0%和64.6%.在肿瘤细胞中,除阴性对照质粒pGL3-control-Luc外,联合组诱导的早期凋亡率明显高于单一治疗方法组,其中pC4-hTC-HRP/IAA系统与放射联合诱导的凋亡率高,HeLa、A549和MHCC97细胞凋亡率分别为39.6%、33.0%和33.2%.结论 新型嵌合启动子C4-hTC具有良好的肿瘤特异性及放射诱导性,放射线联合基因治疗对肿瘤细胞具有特异高效的杀伤作用,在肿瘤的基因放疗中具有较强的应用潜力.
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喉癌组织中P16的表达及意义
细胞周期失控是癌变的重要原因.细胞周期素D1(cyclin D1),能激活CDK4,使细胞由G1期进入S期,进行DNA合成,开始增殖[1].新近发现的新型抑癌基因P16可限制此过程[2,3],P16基因位于人类染色体短臂9p21上,在许多肿瘤细胞系有缺失,缺失率达75%.p16蛋白与cyclin D1竞争地结合CDK4,抑制它的活性,使之解除对Rb的磷酸化,从而不能释放转录因子E2F,阻止细胞由G1期进入S期,抑制细胞无限增殖[3,5].本实验采用免疫组化S-P法,对P16在喉癌组织中的表达进行定量分析,探讨P16在喉癌发生中的作用及P16与喉癌的生物学行为的关系,以判断喉癌患者的预后.
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TRAIL及其受体的研究进展
肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族成员之一,能选择性诱导多种肿瘤细胞系的凋亡,而对正常细胞没有作用.TRAIL通过活化Casepase或线粒体依赖的途径诱导细胞凋亡.这种凋亡信号可以被其诱骗受体(DcR)所阻断,并且受Bcl 2家族蛋白所调节.本文将介绍TRAIL诱导凋亡的信号传导途径以及TRAIL的临床应用.
