2009-2014年深圳市甲型H1N1流感病毒系统进化及分子变异研究

目的 了解2009-2014年深圳市甲型H1N1流感病毒的系统进化及分子变异情况.方法 选取深圳市2009-2014年间分离的41株甲型H1N1流感病毒毒株,提取核酸后利用RT-PCR对其HA基因进行扩增,测序后利用ClustalW 2和MEGA 5.2软件进行序列分析.结果 2009-2014年深圳市分离毒株出现了多个遗传分支,其中2011年同时出现了2个分支.2014年分支与疫苗株"A/California/7/2009"在进化树上相距较远,HA1片段出现了多个氨基酸位点的变异,但变异的位置较为散乱,在抗原决定簇区域内只有N125S、K163T/N/Q、S185T、S203T四个变异,在受体结合区222位的D出现了与重症相关联的N/G/E多元突变.结论 随着年份的递增,甲型H1 N1流感病毒在不断的变异,未来很可能会进化形成一个新的优势流行株.

2009年广东省深圳市B型流感病毒系统进化及分子变异分析

目的 了解2009年深圳市B型流感病毒的系统进化及分子变异情况.方法 对2009年深圳市分离的B型流感病毒的时间分布进行统计分析,并通过MEGA等软件对其HA1基因的系统进化及分子变异情况进行研究.结果 深圳市2009年1-10月均有B型流感病毒流行,3-5月为流行高峰;Victoria系分支"D"的毒株是优势流行株;与2008-2009年度的国际疫苗株相比,Victoria和Yamagata系的HA1分子在其抗原决定簇区均出现了多个氨基酸位点的变异.结论 2009年深圳市B型流感病毒的流行时间长,一些氨基酸位点的变异并没有导致一个新流行株系的形成.

深圳市首例人感染H5N1病毒病例的实验室诊断及分子特点分析

对深圳首例疑似人禽流感病人的标本,进行了RT-PCR、Real-time PCR检测及病毒分离培养、血清中和试验、抗原比检测及发病早期不同病程多份标本的病毒载量分析;对分离物进行了HA基因、NA基因及M基因的核酸检测.结果表明:患者气管吸出物的H5N1亚型和A型流感病毒的特异核酸均呈阳性,并通过细胞培养分离到禽流感病毒A/Guangdong/2/06(H5N1)株.气管吸取物病毒载量随着病程延长逐渐减少,而血清中和抗体水平逐渐上升达到1∶160之后又缓缓下降.A/Guangdong/2/06株8个片段的核苷酸序列显示,其与2005～2006年中国南部的禽流感分离株高度同源,与越南、泰国、印度尼西亚等分离到的禽流感分离株存在明显的差异.

中国大麦黄花叶病毒分离物的分子变异

13个供试的中国和英国大麦黄花叶病毒(BaYMV)分离物,经RNA1和RNA2全基因组不同区域DNA片段单链构象多态性分析(SSCP),外壳蛋白基因和RNA2 70kD基因5'端705碱基序列分析,以及此705碱基DNA片段限制性内切酶图谱分析结果,它们的RNA1和RNA2彼此无一相同,其中RNA2变异比RNA1更大.由于变异十分复杂,且没有规律性,因而当前通用的分子生物学技术尚不能简单地用于BaYMV致病性分化或株系区分和检测.

幽门螺杆中国株cagA全长基因克隆

世界范围内不同Hp菌株CagA分子变异较大,该变异可能导致不同菌株的CagA生物学作用乃至病性不同.

1994-2006年深圳市分离的B型流感病毒分子进化研究

目的 通过对深圳市分离的B型流感病毒HA1分子系统进化分析,初步了解深圳市B型流感病毒的流行变异规律.方法 选取深圳市1994-2006共13年间分离的50株B型流感毒株,通过RT-PCR将其HA1基因片段扩增后进行序列解析,然后,通过MEGA等软件对序列进行分子进化分析.结果 1994-2006年间深圳市流行的B型流感病毒分为Yamagata和Victoria两个亚系,两系的毒株分别是不同年份的主要流行株.两个亚系的HA1分子具有1个糖基化位点的差异,在4个抗原决定簇区域也分布有多个氨基酸位点的变异.结论 1994-2006年间深圳市B型流感病毒的两个亚系分别在不同年份主导流行,但变异均比较缓慢.

2012-2013年深圳市呼吸道合胞病毒流行规律及分子变异分析

目的：初步了解深圳市呼吸道合胞病毒的流行规律及分子变异特点。方法荧光RT-PCR对流感样病例样本进行初筛后，通过巢式RT-PCR对病毒G蛋白基因C端的可变区进行扩增，利用MEGA等软件进行分子变异分析。结果呼吸道合胞病毒在深圳的流行较为普遍，流行高峰一般出现在春季和夏秋季；流行的病毒有A、B两个亚型， NA1和BAⅨ分别是其流行株系的基因型；病毒G蛋白C端的变异位点较为散乱，少数变异导致了病毒糖基化位点消失。一株包含24个氨基酸插入序列的新型重组毒株出现在2013年，此重组株很有可能是由国外传入我国。结论呼吸道合胞病毒在深圳存在持续而广泛的流行，而且病毒仍处在不断的进化和变异之中。

2012 年深圳市鼻病毒基因特性及分子变异分析

目的 通过对2012年深圳市鼻病毒基因特性及分子变异的分析,初步了解深圳市鼻病毒流行及基因变异情况. 方法 荧光RT-PCR对门诊采集的流感样病例样本进行筛查,通过巢式RT-PCR对其VP4~VP2片段和VP1基因进行扩增,利用Clustal W和MEGA等软件进行分子变异分析. 结果 2012年深圳市有A、B两个型别的鼻病毒同时流行,其中A型占多数,包括A47、A31、A90、A18等亚型,其中出现了两株A47和A31的基因重组病毒;VP1分子的变异具有型间差异,且变异位点散乱;不同亚型的受体结合区( BC、DE和HI环)位点并不一致,具有多态性;25个药敏位点中有5个位点(I121V、L123M、V167I、Y189H、H259G)出现了变异. 结论 多个亚型的鼻病毒在深圳存在广泛的流行,而且仍在不断的发生重组和变异.

精准医疗时代重新审视胆管癌的诊治

胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)是一类相对少见的胆系恶性肿瘤.目前极其不良的预后源于对其分子发病机制认识不足和有效治疗方法的匮乏.精准医疗计划的提出和大量分析癌症基因组数据,有助于对肿瘤分子发病机制深入了解以及发现潜在治疗靶点.近年来研究证实肝内、外CCA无论流行病学、病因、分子发病机制、诊治方法和预后都存在较大差异,将CCA按肝内CCA、肝门部CCA和远端CCA分类并深入研究各型生物学特性是迈向精准个体化医疗战略中重要的第一步.相信随着基础和临床研究的深入,CCA各型组学信息的获得、整合和以此为据实施的精准靶向治疗,将改善患者预后,提高总生存率.

异常脂蛋白血症

一、名词解释及影响血脂的生理病理因素"高脂血症"是指血中TC及/或TG水平升高.因为TC与TG是脂蛋白的组成成分,将它们和脂蛋白颗粒组成与代谢联系起来讨论,就出现了"高脂蛋白血症"这一名词.由于病理状态下各种脂蛋白的变化不仅仅是增多或减少,还有组成改变及载脂蛋白的分子变异等,种类繁多,统称为"异常脂蛋白血症"(dyslipoproteinemia),临床上简称为血脂异常(dyslipidemia).高脂蛋白血症是血脂异常的一种类型.

血管紧张素原基因M235T分子变异与原发性高血压的关系

中国苗族人群血管紧张素原基因变异与心肌梗死的关系

本研究通过采用聚合酶链反应、限制性片段长度多态性(PCR/RFLP)分析,来探讨中国苗族人群血管紧张素原(AGT)基因M235T分子变异与心肌梗死(MI)的关系.

妊娠高血压综合征和肾素-血管紧张素系统的基因研究进展

　　妊娠高血压综合征(妊高征)是一种常见的妊娠并发症，是导致孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一。多年来人们对其病因及发病机理进行了大量研究，发现妊高征是一种多因素疾病，环境与遗传因素在其发病中有重要作用。临床研究表明，妊高征具有家族遗传倾向，属于单基因遗传性疾病［1］。　　妊高征的基本病理生理改变是全身小动脉痉挛，临床主要表现为高血压、水肿、蛋白尿。肾素-血管紧张素系统 (renin-angiotensin system，RAS)在血压和体液调节中具有重要作用，并且已发现RAS中某些成分，如血管紧张素原 (angiotensinogen，AGT)，血管紧张素转换酶 (angiotensin conver- ting enzyme，ACE)的某些分子变异与妊高征的发病有关。现就妊高征和RAS的基因研究进展作一阐述。　　一、肾素基因与妊高征的关系　　肾素是RAS中的限速酶，其功能是将AGT转化为血管紧张素I（angiotensin I，AngI）。肾素基因全长12 kb，含9个外显子和8个内含子。动物实验发现，肾素基因限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）与高血压有关［2］。Arngrimsson等［3］调查了9个爱尔兰家庭，每个家庭2～3代中至少有3例妊高征患者，运用内切酶消化及Southern杂交技术检测结果显示，妊高征患者及其配偶间RFLP无统计学差异，由此推测肾素基因RFLP与妊高征的发生无相关性。对人类的原发性高血压与肾素基因RFLP的相关性研究也得出相同结论。　　二、AGT基因突变与妊高征的关系　　在RAS中，AGT是肾素作用的唯一底物，其浓度变化可限制RAS的转化速度，因此在这一系统中占重要地位［4］。人血管紧张素原基因（angiotensinogen gene，AOG）是单拷贝基因，位于染色体1q4，与肾素基因位于同一区域，二者具有一定的相关性。该基因由12～13 kb组成，含5个外显子及4个内含子［5］。Jeunemaitre等［6］研究发现，AOG第2外显子704位上的碱基T突变为C，导致AGT第235位的蛋氨酸（Met，M）被苏氨酸（Thr，T）替换，即M235T与原发性高血压的发生有关。由此推测，M235T可能与妊高征的发生也存在相关性。　　Ward等［7］分别对美国犹他州的白种人群和日本人群进行了调查，测定妊高征患者和正常初孕妇女血中AGT浓度及基因型，研究结果显示，妊高征患者中T235突变频率（0.65）高于正常初孕妇女(0.4)，且差异有统计学意义；同时妊高征患者AGT浓度也高于正常初孕妇女。另外，该研究结果还显示，在不同人种间T235的突变频率也不一样：日本人群（不论妊高征患者还是正常妊娠妇女）中T235出现的频率均明显高于白种人。Kobashi等［8］对日本妇女中M235T和妊高征的相关性进行病例-对照研究，将139例妊高征患者和278例正常妊娠妇女按年龄、产次配对后，用聚合酶链反应（PCR）技术检测血管紧张素原基因型，结果显示，妊高征患者中T235突变频率（0.80）明显高于正常妊娠妇女（0.56）。这就证实了，在日本妇女中T235与妊高征的发生具有一定的相关性。　　但是，Morgan等［9］对英国Nottingham地区48例妊高征患者和84例正常妊娠妇女的研究发现，两组T235等位基因的频率均为0.48。Guo等［10］对澳大利亚和中国（广州，武汉地区）两组人群进行妊高征病例-对照研究，结果提示，虽然在两个不同群体中，T235频率差异有极显著性（澳大利亚人群中T235频率为0.38，而中国为0.75，χ2=31.57，P<0.000 1），但均与妊高征的发生无关。这可能是由于样本量太小，不能保证检验效能；也可能是T235初被发现与原发性高血压的发生有关，而原发性高血压和妊高征在发病机理及病理生理上并不一样。因此认为，T235可能仅与妊高征的一种类型有关，而原发性高血压是这一类型的诱因。　　然而M235T在妊高征发病中确切的作用机理并不清楚，他是否对妊高征的发生有直接作用，抑或仅作为其他至今仍未认识的分子变异的标志。通过对人、鼠AGT以及其他血清蛋白酶抑制物如α1-抗胰蛋白酶、血栓素III等的分子序列比较发现，第235位上氨基酸残基的保守性很差，而且该位点远离肾素作用的位点。对体外培养的哺乳动物细胞研究发现，T235突变并不引起RAS反应动力学的改变［11］。因此，人们开始寻找其他的突变位点。Inoue等［12］对48例妊高征患者DNA样本进行检测，发现在1例重度妊高征患者中存在AOG的另一种变异——L10F，即在第二外显子28位上的碱基C突变为T，导致AGT第10位上的亮氨酸(Leu，L)被苯丙氨酸(Phe，F)替代，而这正是肾素作用的位点；并且L10F突变能产生相应的编码蛋白质进入血液，说明有L10F突变的AGT是有功能的。进一步对含L10F突变的RAS动力学研究发现，L10F突变明显提高了肾素和ACE的催化反应效能，故认为L10F与妊高征的发生有直接关系。另外Inoue等［12］又对200例高危产妇及其新生儿进行DNA检测，发现2例新生儿含L10F，其母亲均患有妊高征；而对巴黎245例高血压患者DNA检测，仅发现2例杂合型L10F；日本的研究未发现L10F，估计其发生率不到1%［13］。而且L10F对RAS动力学影响的研究仅限于体外实验，其确切的作用有待于进一步的活体试验来证实。　　Inoue等［14］还发现，在AGT近端启动子中，转录起始部位上游第6位上的碱基G被A替代，即A（-6）对基因的基本转录有重要作用，能提高AOG的转录活性。而含G（-6）的启动子与反式作用因子优先结合导致转录活性下降。同时，该突变与T235存在明显的连锁不平衡，即携带T235的基因中97%～99%存在A（-6）。因此，虽然M235T不引起RAS动力学的改变，但由于T235与A（-6）存在紧密连锁，故T235转录活性高于M235。虽不能证实其因果关系，但说明转录水平上的细微差异可能引起生理上的改变，从而导致原发性高血压或妊高征的发生。这从转录水平上分析了T235和A（-6）在妊高征发生中的作用。　　AGT的相对分子质量为55×103～60×103，通过凝胶过滤发现的相对分子质量为350×103～500×103的AGT，称为高分子量AGT(high molecular angiotensinogen，HMA），主要存在于羊水和胎盘中，是胎盘中RAS的主要成分。有研究表明，HMA在不同人群中的含量不同（按其占血中总AGT的百分比表示）：男性及生育期妇女为5%，使用雌激素类避孕药妇女为9.6%，正常妊娠妇女为16%，妊高征患者为25%～28%。这说明HMA是妊娠状态下RAS的主要成分，提示它与妊高征的发生有关［15］。HMA可能是由AGT与嗜酸性细胞主要基础蛋白前体（proform of eosinophil major basic protein，proMBP），或二者与补体C3dg以2∶2∶2比例分别通过二硫键共价结合而成。Paule等［16］研究发现，在18、138、232、308位上各含有1个半胱氨酸残基（Cys），其中只有Cys232能与proMBP中的Cys形成二硫键，这是合成HMA所必需的，并且其要受235位上残基的影响。体外实验显示，当232位上的Cys突变为丙氨酸（C232A）时，如果存在M235，则生成的AGT显著下降；如存在T235，则其生成不受影响。而肾素对AGT的水解效能是HMA的1.9倍，说明肾素对HMA的水解效能低。因此可以认为HMA是AGT的贮存形式，尤其是在孕期，可抑制蛋白水解活性，减少AngI的生成。研究还发现，M235T对HMA的产生也有影响，M235生成的HMA［（71.9±3.5）%］比T235高［（57.7±2.8）%］。可以认为M235T在妊高征发生中的作用不是改变肾素反应的动力学参数，而是影响血中HMA的含量从而直接影响AGT的功能。与纯合型T235相比，纯合型M235产生的HMA明显增加；由于肾素对其水解效能低，释放AngI少，从而适应妊娠生理变化，减少妊高征发生的可能性［13］。　　目前多数学者认为，M235T与妊高征的发生有关，但其作用机理不清。可能是其他分子变异的一个标志，如A（-6）与T235存在明显的连锁不平衡，前者能提高AOG转录活性。T235远离肾素作用的位点，并不改变肾素反应的动力学参数；而另一突变位点L10F正好处于肾素作用点，使肾素、ACE催化效能提高2倍多。由于HMA的发现，认为T235可能通过直接影响AGT的功能而引起妊高征的发生；M235产生的HMA高于T235，而肾素对HMA的水解效能低于AGT，故有关T235的作用机理仍需进一步研究。

EML4-ALK融合基因在肺癌中的诊治进展

数十年以来对肺癌的诊治均是从组织学分类的角度着手.近年来随着分子医学的深入开展,对肺癌的认识已经从组织学水平向分子水平深入.在这个过程中,转化医学手段得到更多切实的应用,使得临床在肺癌的诊治方法上已经包括对表皮生长因子受体(EGFR)、KRAS等分子突变状态的检查和应用[1-3].在2007年又一个与肺腺癌相关的分子变异被发现,即EML4-ALK融合基因[4].

免疫组织化学在肺癌诊断中的表达及意义

肺癌是中国发病率和病死率高的恶性肿瘤。据统计，2010年中国肺癌每年新发病例约60万，同年因肺癌死亡的患者约49万[1]。肺癌目前已是我国第一大癌症，成为严重危害人民健康的问题。肺癌大致分为非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）。小细胞肺癌占所有肺癌发病的15%~25%，非小细胞肺癌占所有肺癌的80%~85%，非小细胞肺癌主要包括鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）、腺癌（adeno carcinoma）、大细胞肺癌（lager cell carcinoma，LCC）。随着研究的进展，发现肺癌是有一系列驱动基因形成分子变异的恶性肿瘤，不同的驱动基因突变形成的肺癌在用药和预后方面是不同的。随着个体化治疗方案的日趋进展，临床强烈要求对不同组织学类型明确诊断。免疫组织化学已经是肺癌的诊断及鉴别诊断中不可缺少的检查。

早期肝细胞癌及癌前病变的分子变异特征

肝细胞癌(hepatocellar carcinoma, HCC)是世界上发病率和病死率均位于前列的恶性肿瘤,低度和高度异型增生结节或腺瘤样增生可能是其癌前病变.很多分子变异在肝硬化组织、异型增生结节以及微小HCC结节中即已出现,包括以下6个方面:乙肝病毒整合入宿主基因组引起染色体不稳定性,进而在很多位点发生杂合性缺失,或引起插入突变、激活原癌基因等;丙肝病毒编码产物NS3P表达增加引起c-erbB2的过表达和p21waf的缺失;TSG和原癌基因甲基化状态的改变;1p/q、7q、15q、16p、17q和20q等染色体臂上的DNA增益以及3p、 4q、9p和11q的缺失等;1p、4q、6q和8p在癌前病变和早期体积小、分化好的HCC中出现杂合性缺失;特异性表达于异型增生结节和早期肝癌的分子标签等.这些分子变异既是诊断HCC的重要依据,也可用于筛选肿瘤易感人群,预测这些病变何时向恶性转化,并对某些异常的基因谱系采取适当的治疗策略,进而为HCC患者的早期诊断、早期治疗和改善预后提供新的思路.

2013年深圳市新甲型H1N1流感病毒分子变异研究

目的 了解2013年深圳市新甲型H1N1流感病毒的分子变异情况.方法 用MDCK细胞进行流感病毒分离,收获病毒后提取病毒RNA作为模板,利用RT-PCR对其HA基因进行扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后测序,测序结果用ClustalW2和MEGA3.1软件进行序列分析.结果 2013年的深圳毒株与同年国内外的流行株差异不大,但与同期国际疫苗株A/California/7/2009相比,在进化树上已经产生了明显的分离,且出现了2个不同的进化分支;HA分子有多个氨基酸位点发生了变异,其中有4个变异位点位于抗原决定簇区域内:抗原决定簇Sa的135位点由N变成了S,163位点的K出现了N/Q/I的多元突变;抗原决定簇Sb的185位点由S变成了T;抗原决定簇Ca1的203位点由S变成了T,这些变异的出现会导致病毒抗原性的改变.结论 2013年深圳市流行的新H1 N1病毒有较大可能会形成一个新的优势流行株.

2009年深圳市H3亚型流感病毒分子变异研究

目的 了解2009年深圳市H3亚型流感病毒系统进化及分子变异情况.方法 用狗肾传代细胞(MDCK)进行流感病毒分离,收获病毒后提取病毒RNA,进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PC R),扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后送大连宝生物公司纯化及测序,测序结果用Clustal W2软件和MEGA 3.1软件进行序列分析.结果 2009年的深圳毒株与同期国际疫苗株“A/Brisbane/10/2007”相比差异较大,在HA1区段共发生了7个氨基酸位点的变异:62位的E突变成了K;抗原决定簇A的144位点由N变成了K;抗原决定簇B的158位点由K变成了N;173位的K变成了Q;抗原决定簇B的189位点由N变成了K;194位的P变成了L;213位的V突变成了A.值得注意的是N144K突变导致了144位糖基化位点的消失,这些突变可能已经造成了病毒抗原性的改变.结论 2009年深圳市流行的H3亚型流感病毒很可能是一个新的优势流行株.

应用PCR-SSCP技术快速检测我国水稻条纹病毒的分子变异

应用PCR-SSCP技术快速检测我国水稻条纹病毒病害特异性蛋白(SP)基因和外壳蛋白(CP)基因的分子变异。结果发现我国水稻条纹病毒7个分离物之间存在广泛的变异，其中，PJ分离物的SP基因和JD分离物的CP基因不能扩增出来，能扩增出的6个分离物的CP基因变性电泳后带型各不相同，但SP基固表现出5种带型，其中云南省的YL和BS分离物带型一样。

血管紧张素原基因M235T分子变异与先兆子痫关系的研究

先兆子痫即重度妊娠高血压综合症,是孕产妇死亡的重要原因之一,近年来,国外很多学者认为妊高症与血管活性物质调节失常有关.研究表明,血管紧张素Ⅱ水平的升高能导致蜕膜组织中螺旋动脉的纤维样坏死,因此血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)基因与先兆子痫的关系日益引起人们的重视.