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应用RNA聚合酶Ⅰ反向遗传操作技术构建肾综合征出血热汉坦病毒微复制子
目的 构建肾综合征出血热病原汉坦病毒的微复制子,初步研究汉坦病毒基因组非编码区的调控功能.方法 利用RNA聚合酶Ⅰ体系,将报告基因绿色荧光蛋白(GFP)分别插入汉坦病毒76118毒株三个片段5'和3'非编码区之间,所形成的嵌合cDNA反向插入含RNA聚合酶Ⅰ的表达载体PHH21中,获得汉坦病毒三个片段的微复制子L-GFP-PHH21、M-GFP-PHH21、S-GFP-PHH21,将微复制子转染汉坦病毒76118株预先感染的vero细胞,48h后观察GFP表达情况.结果 汉坦病毒L、M、S三个片段微复制子均能观察到绿色荧光的表达,其中M片段强,L片段微弱.结论 以RNA聚合酶Ⅰ体系为基础构建的汉坦病毒L、M、S三个片段的微复制子是有功能的；汉坦病毒非编码区含有对汉坦病毒转录复制的重要调控原件.此微复制子系统可用于进一步研究汉坦病毒基因结构和功能的关系、基因转录和复制的调控机制,为实现汉坦病毒的病毒拯救奠定基础.
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人肠道病毒D68型微复制子的建立
建立人肠道病毒D68型(EV-D68)微复制子体系.利用增强绿色荧光蛋白(EGFP)或萤火虫荧光素酶(FLuc)报告基因替换病毒编码区,通过酶切连接,构建EV-D68 T7和Pol Ⅰ系统微复制子体系,获得重组质粒pT7-miniEGFP、pT7-miniFLuc、pH H21-miniEGFP、pHH21 miniFLuc和pH H21-miniFLucap.lyC.微复制子转染RD细胞,48h后荧光显微镜观察EGFP表达情况或用双报告系统检测荧光素酶表达水平.T7和Pol Ⅰ系统微复制子均可表达报告基因,但Pol Ⅰ系统荧光素酶表达水平是T7系统的5倍.并且病毒非编码区的PolyC区域对于病毒蛋白的表达起着重要的作用.本研究成功构建了EV-D68微复制子体系,为EV-D68非编码区功能研究提供工具.
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流感病毒两种反向遗传学操作系统的初步构建
目的 构建依赖辅助病毒和宿主细胞内合成病毒核糖核蛋白复合体(vRNPs)的反向遗传学系统,利用上述两系统表达绿色荧光蛋白(EGFP).方法 将EGFP cDNA精确插入人RNA聚合酶Ⅰ启动子和小鼠终止子序列之间,构建RNAPOLI系统,此系统被克隆入pBluescript Ⅱ sk(+),获得重组质粒pBluescript Ⅱ sk(+)tI-EGFP-PIh;基于辅助病毒H1N1,pBluescript Ⅱ sk(+)-tI-EGFP-PIh转染MDCK细胞,观察荧光.来源于甲型流感病毒H1N1分离株A/Puerto Rico/8/34的PB2、PB1、PA、NP 4个基因片段cDNA克隆入载体pcDNA3.1(+),获得pcDNA3.1-PB2、pcDNA3.1-PB1、pcDNA3.1-PA、pcDNA3.1-NP,将pBluescript Ⅱ sk(+)-tI-EGFP-PIh与4个表达质粒共转染293T细胞,观察荧光.结果 所构建的载体均经菌液PCR及测序验证正确;两种转染体系均可观察到绿色荧光.结论 所构建的依赖辅助病毒和宿主细胞内合成vRNPs的反向遗传学系统均可使绿色荧光蛋白表达.
