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应用RNA聚合酶Ⅰ反向遗传操作技术构建肾综合征出血热汉坦病毒微复制子
目的 构建肾综合征出血热病原汉坦病毒的微复制子,初步研究汉坦病毒基因组非编码区的调控功能.方法 利用RNA聚合酶Ⅰ体系,将报告基因绿色荧光蛋白(GFP)分别插入汉坦病毒76118毒株三个片段5'和3'非编码区之间,所形成的嵌合cDNA反向插入含RNA聚合酶Ⅰ的表达载体PHH21中,获得汉坦病毒三个片段的微复制子L-GFP-PHH21、M-GFP-PHH21、S-GFP-PHH21,将微复制子转染汉坦病毒76118株预先感染的vero细胞,48h后观察GFP表达情况.结果 汉坦病毒L、M、S三个片段微复制子均能观察到绿色荧光的表达,其中M片段强,L片段微弱.结论 以RNA聚合酶Ⅰ体系为基础构建的汉坦病毒L、M、S三个片段的微复制子是有功能的；汉坦病毒非编码区含有对汉坦病毒转录复制的重要调控原件.此微复制子系统可用于进一步研究汉坦病毒基因结构和功能的关系、基因转录和复制的调控机制,为实现汉坦病毒的病毒拯救奠定基础.
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乙型脑炎病毒表达载体的研究
用RT-PCR方法分段扩增了乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株5'、3'NCR,利用融合PCR技术在5'、3'NCR之间引入BamHⅠ酶切位点,将5'NCR置于T7启动子控制之下,构建乙脑病毒微复制子表达载体pMR.分别将绿色荧光蛋白(GFP)和汉滩病毒核蛋白编码区基因插入到pMR中,构建两种表达外源基因的乙脑病毒微复制子表达载体:pMR-GFP和pMR-84FliS.经荧光显微镜直接观察、Western blot、ELISA等方法检测,证实外源基因能够在辅助病毒SA14-14-2感染的BHK-21细胞中表达.
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发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒微复制子的建立
发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国新发现的一种布尼亚病毒,可引起人类严重发热伴血小板减少综合征.我们利用RNA聚合酶Ⅰ体系,分别构建SFTSV三个片段L、M、S微复制子,研究其非编码区调控功能.将报告基因绿色荧光蛋白( GFP)或荧光素酶(Luciferase)分别插入SFTSV三个片段5′和3′非编码区之间,所形成的嵌合cDNA反向插入含RNA聚合酶Ⅰ的表达载体pHH21中,获得SFTSV微复制子重组质粒L-GFP-pHH21、M-GFP-pH H21、S-GFP-pHH21、L-Luc pHH21、M-Luc-pHH21和S-Luc-pHH21,分别与成功表达SFTSV聚合酶蛋白(L蛋白)和结构蛋白(N蛋白)的质粒VR1012-L和VR 1012-NP共同转染293T细胞,24～48h后观察GFP表达情况或检测萤光素酶表达量.L、M、S片段GFP微复制子均可观察到特异性绿色荧光.荧光素酶定量结果显示其在不同节段非编码区中的表达量不同,提示SFTSV三个节段的非编码区启动微复制子转录和复制的强度不同.
关键词： 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒 反向遗传学 微复制子 报告基因 -
人肠道病毒D68型微复制子的建立
建立人肠道病毒D68型(EV-D68)微复制子体系.利用增强绿色荧光蛋白(EGFP)或萤火虫荧光素酶(FLuc)报告基因替换病毒编码区,通过酶切连接,构建EV-D68 T7和Pol Ⅰ系统微复制子体系,获得重组质粒pT7-miniEGFP、pT7-miniFLuc、pH H21-miniEGFP、pHH21 miniFLuc和pH H21-miniFLucap.lyC.微复制子转染RD细胞,48h后荧光显微镜观察EGFP表达情况或用双报告系统检测荧光素酶表达水平.T7和Pol Ⅰ系统微复制子均可表达报告基因,但Pol Ⅰ系统荧光素酶表达水平是T7系统的5倍.并且病毒非编码区的PolyC区域对于病毒蛋白的表达起着重要的作用.本研究成功构建了EV-D68微复制子体系,为EV-D68非编码区功能研究提供工具.
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肠道病毒71型微复制子的构建
目的 构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系,研究微复制子的复制及表达情况.方法 聚合酶链式反应扩增绿色荧光蛋白(EGFP),利用特定酶切位点及连接酶,将目的基因片段连接至pMD19-T载体,分别构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系.荧光显微镜下观察微复制子表达情况,实时荧光定量PCR观察微复制子复制情况.结果 EV71非结构蛋白微复制子及EV71 3C蛋白酶微复制子表达后,均可观察到特异性绿色荧光,荧光强度有明显差异;转染后12 ～72 h取样所测RNA含量几乎不变.结论 非结构蛋白全长及3C蛋白酶启动微复制子转录强度不同,所构建微复制子不具备复制功能,提示结构蛋白编码区对病毒RNA复制有重要意义.
