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miR-125b靶向抑制Bak1表达对人髓系白血病细胞增殖的影响
目的 研究微小RNA 125b (miR-125b)在人急性髓系白血病(AML)中的作用,并探讨其对靶基因的调控机制.方法 采用CCK-8计数法检测miR-125b对人AML细胞系NB4、HL-60及人胚肾细胞系HEK-293T增殖的影响.用生物信息学方法预测miR-125b促进细胞增殖的潜在相关靶基因,构建用于鉴定miR-125b靶基因的报告基因载体,并与miR-125b小分子类似物共转染293T细胞,检测报告基因载体中荧光素酶活力.在NB4和HL-60细胞中验证miR-125b与其靶基因的关系.结果 miR-125b能显著促进人NB4和HL-60细胞恶性增殖,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);而对293T细胞没有明显影响.在线软件预测发现促凋亡基因Bcl-2拮抗因子1(Bak1)很可能是白血病细胞miR-125b潜在的1个靶基因;双荧光报告实验结果表明miR-125b能显著地抑制含3'-UTR的Bak1报告基因活性,荧光素酶活性下降53.8％(P＜ 0.01),而对含 3'--UTR突变位点的Bak1报告基因载体没有抑制作用.Western blot检测结果显示NB4和HL-60细胞过表达miR-125b,并显著抑制内源性Bak1的表达(P＜0.01).结论 Bak1是miR-125b在人AML中的一个靶基因.miR-125b很可能通过抑制Bak1表达来促进人AML细胞恶性增殖,从而在AML发病中起类似“癌基因”的作用.
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过表达雌激素相关受体α干预沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染MG63细胞的增殖与分化
背景:雌激素缺乏是绝经后骨质疏松症的主要发病机制,而关于雌激素相关受体α(estrogen-related receptor alpha,ERRα)与骨质疏松症的相关性研究较少,ERRα在骨质疏松症中的具体作用及其机制在目前尚不明确.目的:研究过表达ERRα对沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染的MG63细胞和相关蛋白的影响.方法:构建过表达ERRα和沉默Bak1、Bcl2腺病毒载体,将培养好的MG63细胞分成空载病毒组、Ad-shBak1组、Ad-shBcl2组、Ad-shBak1+shBcl2组,过表达ERRα进行干预.MTT法检测细胞增殖,考马斯亮蓝蛋白定量检测碱性磷酸酶活性,流式法测定钙离子浓度,Western blot法分析骨调节蛋白(骨形态发生蛋白4、结缔组织生长因子、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、肿瘤坏死因子α)的表达.结果与结论:①与空载病毒组对比,Ad-shBak1组的细胞活性、碱性磷酸酶活性均升高,钙离子浓度降低,各骨调节蛋白除肿瘤坏死因子 α 降低外,其余均升高;Ad-shBcl2组细胞活性、碱性磷酸酶活性、结缔组织生长因子均降低,但无显著性意义(P>0.05),钙离子浓度、骨形态发生蛋白4、Runt相关转录因子2均降低,骨桥蛋白、肿瘤坏死因子α显著升高(P<0.01);Ad-shBak1+shBcl2组的细胞活性、碱性磷酸酶活性稍升高,钙离子浓度稍降低,各骨调节蛋白水平均升高,但差异不明显(P>0.05);②与Ad-shBcl2组比较,Ad-shBak1组与Ad-shBak1+shBcl2组细胞活性、碱性磷酸酶活性升高,钙离子浓度显著降低,除肿瘤坏死因子α水平显著降低外,其余骨调节蛋白水平显著升高(P<0.01或P<0.05);③结果提示,过表达ERRα可提高重组腺病毒Bak1转染后的MG63细胞增殖和碱性磷酸酶活性,降低钙离子浓度,且对骨调节蛋白有一定影响作用.
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一组miRNAs在睾丸发育中的表达及miR-125a对精原干细胞发育的调节作用
目的 探究一组精原干细胞(SSCs)中高表达的miRNAs在睾丸不同发育阶段的表达变化及miR-125a对体外培养SSCs增殖和凋亡的调节.方法 采用实时荧光定量RT-PCR研究34个miRNAs在睾丸不同发育阶段的表达变化.通过miR-125a过表达和抑制慢病毒颗粒感染体外培养SSCs,利用CCK8实验和EdU标记及Hoachst 33342、碘化丙啶(PI)双染研究miR-125a对体外培养SSCs增殖和凋亡的影响.后通过实时荧光定量RT-PCR和Western blotting验证促凋亡基因Bak1是否为miR-125a的靶基因.结果 不同miRNAs在睾丸发育过程中具有不同的表达模式.miR-125a能促进体外培养SSCs数目的增加,减少其凋亡的发生.miR-125a过表达能降低体外培养SSCs中Bak1 mRNA和蛋白表达量,而miR-125a的抑制则增加体外培养SSCs中Bak1 mRNA和蛋白的表达量.结论 不同miRNAs在睾丸发育中有不同的表达模式;miR-125a能调控SSCs增殖和凋亡,Bak1在SSCs中是miR-125a的靶基因.
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双荧光素酶报告基因系统验证hsa-miR-326对BCL2L1、BAK1的靶向调控
目的 构建psiCHECK2荧光素酶报告基因载体,验证hsa-miR-326对BCL2L1和BAK1表达的影响.方法 设计合成包含与hsa-miR-326结合序列及其突变型序列的BCL2L1和BAK1基因片段,构建荧光素酶报告基因载体,转染293T细胞,通过荧光素酶活性变化观察hsa-miR-326对BCL2L1和BAK1表达的影响.结果 hsa-miR-326对BCL2L1组的荧光表达有非常显著的抑制作用(P＜0.01);而对BCL2L1-mut、BAK1和BAK1-mut组的荧光表达没有显著的抑制作用(P＞0.05).结论 hsa-miR-326可以调控BCL2L1的表达,但对BAK1的表达未见影响,推测hsa-miR-326可能通过下调BCL2L1参与血小板的凋亡.
关键词： hsa-miR-326 双荧光素酶报告基因 BCL2L1 Bak1 -
芹菜素对胶质瘤U87细胞的抗增殖作用及其机制研究
目的 探讨芹菜素对人胶质瘤细胞的抑制作用及其分子学机制.方法 人胶质瘤U 87细胞给予0、20、40μm o l/L芹菜素,通过MTT评价细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡.进一步U87细胞转染Bak1 siRNA,24 h后给予芹菜素刺激,体外观察细胞的增殖和细胞凋亡情况,Western blot检测Bak1表达.结果 芹菜素可有效抑制胶质瘤细胞生长,诱导其凋亡.抑制Bak1表达后,芹菜素抑制胶质瘤增殖能力下降,未见细胞发生凋亡.结论 芹菜素抑制胶质瘤细胞生长促进其凋亡是通过活化Bak1蛋白实现的.
