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慢性B淋巴细胞白血病患者免疫球蛋白Fab段基因克隆及其可变区序列分析
目的分析慢性B淋巴细胞白血病患者外周血单个核细胞免疫球蛋白Fab段基因.方法提取慢性B淋巴细胞白血病患者外周血单个核细胞RNA,选用与Ig FR1 5′和CH1Cμ 3′或CL区(Cκ/Cλ)3′互补的多对引物,通过RT-PCR扩增Ig Fab段基因,进行克隆和序列测定,并通过DNAtools和计算机网络对其可变区基因同源性进行分析和基因家族归类.结果 7例患者中4例外周血单个核细胞扩增出轻链基因,3例扩增出重链基因.所扩增的4条轻链基因均属于κ轻链,3条重链均为μ链基因.利用DNAtools分析软件,对轻链和重链分别进行同源性比较,3条重链可变区基因差异较大,轻链可变区基因具有一定的同源性.对所扩增的Ig基因进行归类,结果4例患者的轻链均属于Vκ I 亚组;3例患者的重链中2例属VH3 家族,1例为VH5家族.结论慢性B淋巴细胞白血病患者存在独特的决定簇和相似决定簇.
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T细胞受体β独特型抗原决定簇DNA疫苗诱导抗淋巴瘤抗体的研究
目的观察T细胞受体(TCR)β不同独特型抗原决定簇DNA疫苗诱导BALB/c小鼠抗人类CEM淋巴瘤细胞免疫反应的情况.方法RT-PCR扩增CEM细胞特异性重排的TCR β基因片段,克隆至真核表达载体pcDNA3中,然后以此为模板,扩增编码不同抗原决定簇的基因片段,分别克隆到pcDNA3中作为DNA疫苗.肌肉注射法免疫小鼠,间接免疫荧光法检测小鼠血清中抗体生成情况.结果CEM细胞TCRβ共包含5个抗原决定簇,其DNA疫苗免疫的6只小鼠全部产生了特异性抗独特型抗体(高滴度l:480);含4个抗原决定簇的DNA疫苗免疫的6只小鼠中有4只产生了特异性抗独特型抗体,但滴度均较低(高滴度1:80);仅含2个抗原决定簇的DNA疫苗未能使小鼠产生特异性抗独特型抗体.结论包含TCRβV区全长,共有5个抗原决定簇的独特型DNA疫苗可以诱导小鼠产生抗淋巴瘤细胞的独特型特异性抗体;含有4个抗原决定簇的DNA疫苗仍可诱导特异性抗体的生成,但这种反应较弱;而仅含有2个抗原决定簇的DNA疫苗则不能诱导小鼠产生抗淋巴瘤的特异性抗体.
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海洋真菌多糖YCP的拟糖蛋白制备及其免疫原性比较
目的:研究海洋真菌(Phoma herbarum YS4108)多糖YCP的免疫学性质.方法:将YCP与牛血清白蛋白(BSA)共价偶联,获得取代度(BSA/YCP)分别约为3、6和10的3种拟糖蛋白,经皮下分别接种ICR小鼠,测定免疫血清中多糖YCP的特异性抗体IgM和总IgG水平,以及半抗原和载体蛋白的特异性IgG亚型.结果:拟糖蛋白诱导小鼠产生强烈的抗YCP的IgM初次应答和IgG回忆应答.其中,抗多糖IgG亚型依次为IgG2a、IgG2b、IgG1和IgG3;而抗载体蛋白IgG亚型依次为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3.结论:YCp诱导小鼠主要分泌IgG2a独特型抗体.
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TCR Vβ8/pcDNA3.1重组质粒的构建
目的:构建重组质粒TCR Vβ8/ pcDNA3.1.方法:从人淋巴瘤Jurkat 细胞中提取mRNA,经RT-PCR法获取TCR Vβ8基因;将表达质粒pcDNA3.1和TCR Vβ8基因行BamHI和HindⅢ双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5а感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定.结果:电泳获得523 bp的TCR Vβ8预期条带, 测序证实为正确的TCR Vβ8目的基因序列.结论:测序是构建TCR Vβ8/pcDNA3.1重组质粒的重要步骤.
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T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗诱发小鼠体液免疫反应
目的:研究T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗诱发小鼠体液免疫反应.方法:大剂量提取质粒,将BALB/c小鼠随机分为pcDNA3.1组、pcDNA3.1/TCR Vβ8组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+ IL-2组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+脂质体组和全硫代CpG组共5组(每组6只),双侧股四头肌内注射疫苗免疫,于第0、2、4周各免疫1次,共3次.每次免疫前及免疫开始后至第8周,取鼠血,应用间接免疫荧光法检测小鼠抗体生成情况.结果:pcDNA3.1/TCR Vβ8组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+脂质体组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+IL-2组小鼠血清中均产生了特异性抗独特型抗体,抗体滴度在第4周开始增高,第6周时达到高峰.在同一取血时间,pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+脂质体组和pcDNA3.1/TCR Vβ8+IL-2组小鼠抗体滴度均高于pcDNA3.1/TCR Vβ8组(P<0.001).结论: DNA重组质粒pcDNA3.1/TCR Vβ8可诱导小鼠产生特异性抗淋巴瘤细胞的独特型抗体;IL-2 、CpG和脂质体增强了TCR Vβ8基因疫苗诱导的体液免疫反应.
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T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中的基因及蛋白表达
目的:检测T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗的基因表达.方法:大剂量提取质粒,将BALB/c鼠随机分为pcDNA3.1组、pcDNA3.1/TCR Vβ8组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+ IL-2组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+脂质体组和全硫代CpG组共5组(每组6只),双侧股四头肌内注射疫苗免疫,于第0、2、4周各免疫1次,共3次.接种疫苗后5 d,用RT-PCR法检测重组质粒mRNA表达.接种疫苗后7 d应用免疫组化检测重组质粒蛋白表达.结果:pcDNA3.1/TCR Vβ8组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+ IL-2组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+脂质体组小鼠骨骼肌中均显示mRNA和蛋白表达,而pcDNA3.1组和全硫代CpG组未见mRNA和蛋白表达.结论:T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中有效地表达了基因产物.
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利用pIRES载体构建TCR独特型重组质粒
目的 利用可同时表达两个基因片段的pIRES作为载体,构建TCR独特型重组质粒,为制备诱导抗T细胞肿瘤免疫的TCR独特型DNA疫苗提供基础.方法 设计引物,提取Jurkat及Molt4细胞株RNA为模板,RT-PCR法特异性扩增CDR3区,与pIRES经酶切连接后氯化钙法转化,重组质粒经酶切鉴定后测序.结果 构建出3种重组质粒pIRES-Jurkat Vβ8、pIRES-Molt4 Vβ2①和pIRES-Molt4 Vβ2②,其中pIRES-Molt4 Vβ2②测序正确,可体外表达Vβ2蛋白.结论 利用真核表达载体pIRES可成功构建TCR重组质粒,并有可能用于进一步克隆佐剂基因片段入pIRES的多克隆位点,提高DNA疫苗的免疫原性.
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B细胞淋巴瘤的抗独特型免疫治疗
0 引言随着对肿瘤免疫机制的不断了解,肿瘤的免疫治疗逐渐成为人们研究的热点.寻找能够有效激发机体免疫反应的肿瘤特异性抗原是进行免疫治疗的关键.B细胞淋巴瘤在此方面有着特殊的优势,表达于B细胞表面的免疫球蛋白(Ig)可变区的独特型(idiotype,Id)可作为肿瘤特异性抗原,诱导产生抗独特型抗体和/或激活T细胞介导的细胞免疫,从而用于免疫治疗.本文将对B淋巴瘤的抗独特型免疫治疗作一简要综述.
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CPP-Id对小鼠树突细胞表面共刺激分子表达的影响
背景与目的:B细胞淋巴瘤的独特型(idiotype,Id)免疫球蛋白可作为肿瘤特异性抗原诱发免疫反应抑制肿瘤的发展.本实验拟探讨小鼠淋巴瘤细胞株A20中Id-CTL表位的存在,了解细胞穿透肽(cell-penetrating peptide,CPP)负载的Id(CPP-Id)进入树突细胞(dendritic cell,DC)的量,以及在细胞内的分布和进入细胞的时相,同时检测其对DC表面标志表达的影响.方法:用RT-PCR方法扩增A20细胞株的Id抗原CTL(cytotoxicity lymphocyte)表位的基因片段,并测序确定氨基酸的序列;通过流式细胞仪检测CPP-Id与Id进入小鼠DC的量的差异及抗原负载前后的DC表型的表达;共聚焦显微镜观察CPP-Id进入细胞的过程及时间;荧光显微镜观察CPP-Id在细胞内的分布.结果:RT-PCR扩增产物为660 bp的片段,测序结果表明A20细胞株的Id抗原CTL表位的基因存在.共聚焦显微镜检测显示CPP-Id能在初200 s内快速进入DC,单纯Id进入DC的量很少.10 μmol/L的CPP-Id负载的DC细胞平均荧光强度(MFI)高于单独使用Id组(4.35±0.48 vs.1.14±0.33,P＜0.005);两者负载的DC表面标记CD80、CD86、CD54及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子表达均比未成熟DC明显增加.结论:CPP-Id比Id进入小鼠DC的量明显增加,CPP肽可以提高Id抗原进入细胞的效率;CPP-Id体外冲击DC后,可以使DC表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子,协同刺激分子CD80、CD86以及粘附分子CD54表达显著增高,有利于活化CTL.
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独特型-抗独特型免疫网络及其在特发性血小板减少性紫癜中的作用
免疫网络是现代免疫学研究的热点之一,在许多自身免疫性疾病的发生及治疗方面有重要意义.特发性血小板减少性紫癜(ITP)尤其是难治性特发性血小板减少性紫癜的发生及治疗仍是一个难题.本文探讨了独特型-抗独特型抗体在ITP发病中的意义,分析和展望了利用其治疗ITP的免疫机理及正在研究中的具体方法.
关键词： 特发性血小板减少性紫癜 独特型 免疫网络 -
具有乙酰胆碱酯酶催化活性的抗体酶的研究
目的: 研制具有乙酰胆碱酯酶 (AchE) 活性的抗独特型抗体.方法: AchE mAb是一种IgG1抗体, 先用木瓜蛋白酶酶切, 然后采用AchE-Sepharose-4B和SPA亲和层析柱进行提取纯化, 获得纯化的mAb Fab段.以Fab作为抗原免疫小鼠, 制备抗Fab片段的独特型抗体(AId Ab).结果: 酶催化ELISA法检测证明, 抗mAb 3F3片段的AId Ab具有AchE活性.结论: 成功地制备了一株具有AchE活性的AId Ab,为农药中毒的治疗开辟了新的途经.
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创伤弧菌独特型单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的研制创伤弧菌独特型单克隆抗体(mAb)并进免疫学特性分析.方法用纯化的抗创伤弧菌mAb 1A1免疫BALB/c小鼠,ELISA法鉴定独特型mAb的特异性,用牙鲆鱼进行感染保护实验.结果共获6株创伤弧菌独特型mAb,其中两株具有较好的模拟菌体抗原表位,并具有自动免疫保护抵抗创伤弧菌感染的能力.结论本研究制备的创伤弧菌独特型mAb可作为模拟菌体抗原用于免疫疫苗预防研究.
