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质粒shRNA体内干扰Klotho基因对窦房结通道基因表达的影响
目的 通过质粒shRNA体内干扰,研究Klotho基因与窦房结起搏通道相关基因HCN4及HCN2之间的关系,为病窦综合征的研究提供新思路.方法 取C57BL/6J小鼠25只,分为5组,每组5只:未处理组、质粒shRNA 12 h组、质粒shRNA 24 h组、生理盐水12 h组、生理盐水24h组.质粒shRNA组为尾静脉注射质粒shRNA50μl(1μg/μl),生理盐水组为尾静脉注射生理盐水50μl,未处理组不予任何处理.分别于注射12 h及24h后取窦房结周围组织,行Western blotting检测各组小鼠的Klotho、HCN2、HCN4基因的蛋白表达水平.结果 质粒shRNA 12 h组(0.24±0.09)的Klotho蛋白水平表达量较低,与未处理组(3.19±0.42)及生理盐水12 h组(2.34±0.41) Klotho蛋白表达量相比,差异均存在统计学意义(P值均为＜0.001).质粒shRNA 12 h组(1.55±0.89)的HCN4蛋白水平表达量与未处理组(2.56±0.54)及生理盐水12 h组(3.05±0.46) HCN4蛋白表达量相比差异均存在统计学意义(P值分别为0.015及0.001).结论 小鼠Klotho基因通过其蛋白表达可能会干扰窦房结起搏基因的蛋白表达.
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窦房结细胞起搏基因HCN4的研究进展
HCN即超级化激活的环核苷酸门控阳离子通道,其激活后产生的If/Ih离子流是窦房结起搏细胞动作电位正常形成的分子基础.随着对窦房结细胞起搏机制和HCN基因家族研究的不断深入,人们对HCN亚型HCN4的结构、分布、特性已有了较深入的了解.近年来有较多研究表明,人窦房结起搏基因HCN4突变与病态窦房结综合征密切相关.现就窦房结细胞起搏基因HCN4的特性及其与窦房结功能之间的关系作进一步研究和探讨.
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HCN4与生物心脏起搏的基础研究现状
HCN4作为超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因家族亚型,被认为是心脏起搏细胞产生自动节律重要基础,其中超极化激活电流(funny current,If)是重要的起搏调控部分,HCN家族基因参与编码If电流,由于HCN4与心脏起搏的产生和调节关系密切,所以被称为起搏基因.
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大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌HCN2及HCN4基因的表达
背景:研究表明在多种心脏疾病后的心室肌中HCN2和HCN4表达异常,且与室性心律失常密切相关.骨髓间充质干细胞移植可修复受损心肌,但对梗死后心室离子通道重构的影响仍不清楚.目的:检测大鼠骨髓间充质干细胞移植入梗死心肌后左心室HCN2和HCN4的表达变化.方法:取3周龄SD大鼠5只,Percoll法分离培养骨髓间充质干细胞.成年健康雄性SD大鼠30只,随机分为4组:DMEM组、细胞移植组大鼠建立急性心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎,正常对照组不进行任何干预.造模后4周,DMEM组在梗死边缘区和中心区分5点注入DMEM培养液,细胞移植组同法注入第3代骨髓间充质干细胞悬液200 μL,细胞数5×10~6个.采用RT-PCR及Western-blot法检测左心室HCN2,HCN4在mRNA及蛋白水平的表达.结果与结论:正常心肌区:各组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达基本相似(P > 0.05).梗死边缘区:DMEM组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显多于正常对照组、假手术组(P < 0.05);细胞移植组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显少于DMEM组(P < 0.05).梗死中心区:DMEM组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显少于正常对照组、假手术组(P < 0.05);细胞移植组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达与DMEM组基本相似(P > 0.05).提示急性心肌梗死后梗死边缘区HCN2,HCN4基因在mRNA和蛋白水平的表达升高,骨髓间充质干细胞移植可能通过下调梗死边缘区HCN2,HCN4的表达来降低心律失常.
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构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率
背景:超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前受关注的生物起搏备选基因.目的:构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率.设计、时间及地点:细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供.携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存.腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司.方法:质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;1-Ceu Ⅰ+1-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率.结果:构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp(pshutIle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用Xho Ⅰ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×10~(11) PFU/mL.成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率高,达90%.结论:实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞.
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心源性猝死者窦房结病理学观察和HCN4、CX45的表达及其意义
目的:研究心源性猝死者窦房结病理学改变和超级化激活环核苷酸门控阳离子通道基因4(HCN4)、缝隙连接蛋白45(Cx45)的表达.方法:实验组为21例心源性猝死者,对照组18例(交通事故损伤致死9例,心脏破裂4例,肝破裂3例,脾破裂2例).经HE染色观察窦房结的形态学变化;应用免疫组化检测HCN4和Cx45在窦房结的表达.结果:心源性猝死组HCN4的表达高于对照组(P＜0.05),心源性猝死者窦房结Cx45的表达明显低于对照组(P＜0.01).结论:窦房结病理改变是引起心源性猝死的重要原因之一,HCN4表达的增高和Cx45表达的减少与心源性猝死的发生有一定的相关性.
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HCN4在人和动物正常窦房结功能中的作用
窦性心动过缓是一个很常见的临床症状,但是导致窦房结功能异常的细胞学机制尚未明确.某些特殊个体如运动员,其心律常慢于正常人群,却并非病理现象.对于一部分人,引起心动过缓的原因可以由其他疾病引起,例如先天性异常、心肌炎、营养不良、心肌病、心脏结构重构及窦房结纤维化等[1].
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风湿性心脏病心房颤动HCN4基因mRNA表达的实验研究
目的:通过对风湿性心脏病心房颤动(房颤)患者右心耳组织HCN4基因mRNA表达的检测,探讨其与房颤的关系.方法:将28例风湿性心脏病患者,根据是否存在房颤分为房颤组(18例)和窦性心律组(10例).术前对所有患者行心脏彩色多普勒超声检测,术中取右心耳组织,应用RT-PCR技术检测HCN4mRNA表达,并进行分析.结果:房颤组和窦性心律组左房径[(61.89±21.64)mm∶(45.10±10.48) mm]、HCN4 mRNA表达水平[(0.775 4±0.685 6)∶(0.258 4±0.215 7)]均差异有统计学意义(均P＜0.05).结论:风湿性心脏病房颤的发生中,HCN4mRNA表达异常增高,左房径增大.
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体内外获取心脏起搏细胞的方法学探讨
目的:体外诱导人诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)分化为心脏起搏细胞,体内解剖精确定位获得兔窦房结组织,进而直接获得心脏起搏细胞.方法:体外Cellapy法高效诱导人iPS细胞分化为心肌细胞和心脏起搏细胞,肉眼观察心脏起搏细胞形态及起搏频率,免疫荧光检测人iPS源性心脏起搏细胞中特异性标志物HCN4阳性比例.体内解剖精确定位获得兔心脏起搏细胞后,应用qRT-PCR及免疫印迹法检测兔心脏起搏细胞HCN4 mRNA及蛋白表达水平.结果:运用Cellapy方法成功将人iPS细胞诱导分化为具有自发跳动特性的心脏起搏细胞,显微摄像记录显示心脏起搏细胞搏动频率为(70.60±2.71)次/min,且细胞形态以梭型为主;免疫荧光显示人iPS源性心脏起搏细胞中HCN4蛋白阳性细胞占(9.42±1.57)％.同时,qRT-PCR及Western blot结果显示兔窦房结组织中心脏起搏细胞HCN4表达明显高于心房肌和心室肌(P＜0.01).结论:体外Cellapy诱导法和动物体内解剖精确定位是获得心脏起搏细胞的两种有效方法.这为研究病态窦房结综合征的发病机制提供了可靠的细胞来源,同时为病态窦房结综合征的治疗提供了移植细胞.
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HCN4在缺血诱导乳兔窦房结细胞损伤中的作用
目的:观察乳兔窦房结细胞在缺血条件下HCN4的表达变化及其对窦房结功能及细胞凋亡的影响.方法:将原代培养的乳兔窦房结细胞分为正常对照组和模拟单纯缺血组(缺血1h、3h、6 h);采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中HCN1-4的表达;采用细胞免疫荧光方法检测窦房结细胞内HCN4蛋白的亚细胞分布;采用RT-qPCR检测Bax和Bcl-2的表达;采用全细胞膜片钳记录单个窦房结细胞的If电流,并运用HCN通道抑制剂伊伐布雷定观察抑制HCN4对乳兔窦房结细胞电活动的影响.结果:原代乳兔窦房结细胞主要表达HCN4,少量表达HCN1和HCN2,HCN3 mRNA未检出,Western blot仅检测出HCN4,未检测出HCN1、HCN2、HCN3的蛋白水平,HCN4蛋白广泛分布于细胞质内;膜片钳可记录到单一窦房结细胞自发起搏电流,伊伐布雷定可通过特异性的降低窦房结舒张期去极化速率来延缓自发活动,伊伐布雷定可持续抑制窦房结细胞的If电流产生,使If明显减小;与正常对照组相比,随着缺血时间的延长(1h、3h、6 h),HCN4 mRNA表达及蛋白水平逐渐减少,同时Bax mRNA表达及蛋白水平明显上调,Bcl-2 mRNA表达及蛋白水平明显下降;急性缺血处理显著抑制了窦房结细胞的电活动,与正常对照组相比,随着时间的延长,窦房结细胞的起搏电流If也逐渐减少.结论:HCN4蛋白参与调控乳兔窦房结细胞的起搏功能.急性缺血可引起窦房结细胞凋亡,导致HCN4的表达下降,使得通道It电流密度减少导致窦房结功能障碍.
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携带人HCN4与Tbx3基因慢病毒的构建
目的:构建携带人环核苷酸门控离子通道基因(HCN4)、发育调控相关转录因子基因(Tbx3)及增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的慢病毒载体,获得可供转染的滴度,为进一步研究Tbx3对HCN4异位表达及细胞起搏功能的影响提供高效的慢病毒转基因平台.方法:应用聚合酶链反应(PCR)方法,扩增HCN4及Tbx3基因,利用Gateway技术分别构建出HCN4-Tbx3-EGFP、HCN4-EGFP、Tbx3-EGFP、EGFP 4种慢病毒表达载体.经PCR及基因测序鉴定后,脂质体法转染293FT包装细胞,产生相应慢病毒,测定其滴度,荧光显微镜下观察EGFP的表达.结果:PCR和测序证实,构建出携带有HCN4-Tbx3-EGFP、HCN4-EGFP、Tbx3-EGFP及EGFP基因的慢病毒表达载体.分别转染293FT细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光,病毒滴度测定结果分别为4.7×107 TU/ml、5.2×107 TU/ml、4.5×107 TU/ml、6.65×107 TU/ml.结论:成功构建同时携带HCN4、Tbx3基因及EGFP基因的慢病毒载体并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒,为通过HCN4联合Tbx3基因长期稳定的表达来构建窦房结细胞的实验研究提供高效稳定的转基因技术平台.
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以HCN4为靶向的参仙升脉口服液治疗窦性心动过缓机制探究
目的 通过观察参仙升脉口服液(SXSM)对人源超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4(HCN4)编码的离子通道If的影响,探讨SXSM治疗缓慢性心律失常的药理机制.方法 进行大鼠离体心脏灌流实验,从功能上检测SXSM对心率(HR)和冠脉压(CPP)的影响.全自动膜片钳Ionworks方法记录SXSM对If电流的影响.结果 SXSM用药前后,HR分别为(199±19) BPM和(284±27)BPM,CPP分别为(127.7±37.9) mmHg和(107.8±28.9) mmHg.与空白对照相比,差异有统计学意义(P＜ 0.05);10mL· L-1的SXSM能够使HCN4编码的If电流增加至(126.55±35.65)％,与空白组比差异有统计学意义(P＜0.01).结论 SXSM对HCN4编码的If电流有明显提升作用,提示SXSM治疗窦性心动过缓可能是通过影响If电流发挥其药效.
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1型糖尿病大鼠左心室HCN2和HCN4重构
目的 探讨1型糖尿病大鼠左心室肌HCN2和HCN4的表达时空变化.方法 60只大鼠随机分为正常对照组(N组,n=20)和1型糖尿病组(T1DM组,n=40):腹腔注射链脲佐菌素制作大鼠1型糖尿病模型.90 d后,取左心室肌通过免疫荧光法检测HCN2、HCN4的定位;Western-blot、RT-PCR技术检测HCN2、HCN4在蛋白质及mRNA水平的变化.结果 免疫荧光结果显示HCN2在心室肌细胞膜上呈点状或短线状不连续表达;HCN4未见表达.Western-blot、RT-PCR结果显示T1DM组大鼠HCN2、HCN4在蛋白及mRNA水平表达升高.结论 1型糖尿病大鼠左心室出现离子通道HCN2、HCN4表达升高,导致糖尿病心脏电重构,可能与糖尿病引起的室性心律失常有关.
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HCN4基因体外转染大鼠MSCs建立起搏离子通道
目的:通过构建HCN4腺病毒载体,以大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)为基因转染的平台,观察HCN4外源基因对MSCs转染效果及其功能表达.方法:携带HCN4腺病毒载体体外转染MSCs,测定转染效率,免疫荧光法测定HCN4蛋白表达,膜片钳全细胞记录If电流.结果:携带HCN4腺病毒载体体外转染MSCs后可检测到HCN4蛋白及If电流表达.结论:携带HCN4腺病毒载体转染大鼠MSCs后可使MSCs表达HCN4蛋白及If电流,可为生物心脏起搏治疗提供合适的靶基因及种子细胞.
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螺内酯对大鼠心肌梗死后梗死周边区超极化活化环核苷酸门控通道表达的影响
目的 了解大鼠急性心肌梗死后梗死周边区心肌中HCN2、HCN4的mRNA和蛋白表达变化,探讨螺内酯对心肌梗死后梗死周边区心肌中HCN2、HCN4表达的影响.方法 通过开胸结扎冠状动脉左前降支的方法成功建立大鼠心肌梗死模型,心梗后24h存活的12只大鼠随机分为心梗组及螺内酯组,6只假手术组的大鼠仅穿线通过左冠状动脉前降支而不结扎动脉.心肌梗死后一周取心梗大鼠的梗死周边区心肌组织,而假手术组取相对应的心肌组织,用荧光定量PCR方法检测HCN2、HCN4的mRNA水平,用Western blot方法检测HCN2、HCN4的蛋白水平.结果 心梗组和螺内酯组较假手术组HCN2、HCN4的mRNA和蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),而螺内酯组较心梗组HCN2、HCN4的mRNA和蛋白表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05).结论 急性心肌梗死后1周梗死周边区心肌组织中HCN2和HCN4通道蛋白的表达明显升高,而螺内酯能明显减少急性心肌梗死后梗死周边区心肌组织中HCN2和HCN4通道蛋白的表达.
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原代培养乳鼠窦房结细胞的形态学及表面抗原研究
目的 建立乳鼠窦房结细胞(SNC)的体外分离纯化培养方法,了解SNC的形态结构特点,观察表面抗原超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因4(HCN4)和缝隙连接蛋白45(Cx45)的细胞表达特点,为细胞生物起搏的深入研究提供一定实验依据.方法 取新生SD乳鼠的窦房结组织,胰酶逐次消化,并予差速贴壁及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)纯化处理进行原代窦房结细胞的培养.结果 在培养的窦房结细胞中可观察到3种形态的细胞,即梭形细胞、三角形细胞和多边形细胞,其中梭形细胞所占比例大,搏动频率快,细胞器不发达,肌原纤维稀少,表达HCN4和Cx45;三角形细胞微量表达Cx45.结论 ①胰酶消化法结合差速贴壁及5-BrdU处理,是可靠的窦房结细胞纯化培养技术;②搏动频率快、HCN4和Cx45表达阳性的梭形细胞可能系窦房结起搏细胞.
