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股骨头坏死再生治疗的研究进展
股骨头坏死（necrosis of the femoral head, ON-FH）是以股骨头血供严重减少和骨内压增高为病理特征的疾病。创伤和非创伤等原因均可以通过损害股骨头内血液循环的途径导致ONFH，但其发病机制至今尚未完全明确。股骨头缺血可引起骨髓细胞和骨细胞的死亡，终导致坏死区塌陷[1]。ONFH是一种常发生于中青年患者的致残性疾病，晚期可引起髋关节骨关节炎。以细胞、生物材料支架和生物活性因子为代表的再生医学是目前ONFH有前景的治疗方法之一，已被证明可以改善临床疗效。ONFH早期的股骨头软骨下骨板结构完整，可以通过保留股骨头的手术治疗，如髓芯减压术可以降低骨内压、诱导骨重建。浓缩骨髓源性细胞通过体外扩增的间充质干细胞以及成骨或成血管源性生长因子（或两者兼有）在促进骨再生方面具有巨大的潜能。ONFH进展期伴有软骨下骨板塌陷者则需要行软骨下骨重建术以获得保留关节功能的效果。与膝关节类似的顺行骨软骨重建手术技术如骨软骨移植术（镶嵌式成形术）、基于基质自体软骨细胞植入或仅使用无细胞基质移植，被认为可以保留关节功能、降低髋关节置换的需要。ARCOⅠ期和Ⅱ期ONFH由于软骨下骨板结构稳定，髓芯减压、带血管或不带血管蒂骨移植术以及股骨近端截骨术等关节保留技术仍然效果良好；而随着病情进展，ARCOⅢ期和Ⅳ期ONFH的软骨下骨板塌陷，长期随访多数病例需行全髋关节置换术（total hip arthroplasty, THA）。
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器官特异性无细胞基质移植物的研究进展
同种器官供体十分有限和随机,且受到组织配型的限制.去除器官组织中的细胞成分,使宿主对移植物的抗原反应程度降到低,有望使随机的器官特异性无细胞异体或异种基质移植物成功.1964年Grillo等[1]先对皮肤组织进行脱细胞处理,1977年Oliver等[2]通过胰蛋白酶处理皮肤得到无细胞真皮胶原用作临床创面敷料,1989年Badylak SF用猪小肠制备成无细胞基质移植物(acellular matrix grafts,AMGs)成功地进行狗动脉血管搭桥,直至1995年Wainwright[3]研制出无细胞真皮基质(ADM,商品名"AlloDerm")充当复合皮永久性真皮替代物并成功地应用于临床.这些组织经脱细胞处理目的在于清除器官组织内全部细胞,同时保持该组织的细胞外基质(ECM)结构及其生物化学特性[4],以获得组织或器官重建的大效价.此后,多种来源的AMGs被用作器官缺损的生物假体,已经在动物实验和临床试用中获得部分功能重建,成为重建外科崭新的研究领域.
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冻干无细胞膀胱黏膜下基质修复兔尿道缺损
目的探讨冻干无细胞膀胱黏膜下基质修复尿道缺损的效果.方法应用反复冻融-酶法及冷冻干燥技术制备冻干无细胞人体膀胱黏膜下基质.18只新西兰白兔建立尿道中段部分缺损模型,尿道缺损面积约1.0 cm×0.5 cm.其中14只兔作为实验组,以冻干无细胞膀胱黏膜下基质修补尿道缺损,术后1、2、3、4、8、12、24周分别取2只行逆行性尿道造影,观察尿道情况,并采取尿道组织进行大体、组织学及超微结构观察;4只兔作为对照组,未采用任何材料修补尿道缺损,直接缝合尿道海绵体包膜、皮下组织及阴茎皮肤,术后2、4周分别取2只行逆行性尿道造影,采取尿道组织进行大体观察.结果实验组14只兔均未发现明显的尿道狭窄.冻干无细胞膀胱黏膜下基质组织相容性良好,移植后无细胞膀胱黏膜下基质内有细胞长入,新生血管形成,术后2周无细胞膀胱黏膜下基质移植区完全上皮化.随着移植时间的延长,移植区胶原纤维排列由紊乱趋于规则.结论冻干无细胞膀胱黏膜下基质能够诱导尿道黏膜细胞迁徙、生长和上皮化,初步认为可以作为尿道缺损修复材料.
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一种优化的猪骨骼肌来源无细胞基质支架材料制备方法及鉴定
目的 探讨一种优化的猪骨骼肌脱细胞制备方法,以期制备理想的猪骨骼肌来源无细胞基质(decellularized porcine muscle tissue,DPMT)支架材料.方法 取市售新鲜健康成年家猪腰部骨骼肌组织,采用匀浆-球磨-去垢剂多步骤脱细胞方案制备DPMT.行组织学观察脱细胞、脱脂效果,天狼猩红染色分析胶原成分,扫描电镜观察材料内部微结构;测定材料中DNA含量及总蛋白质含量.取人脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)、小鼠成纤维细胞(NIH3T3)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),置于不同浓度DPMT浸提液中,培养后第1、3、5天采用细胞计数试剂盒8法测算细胞相对增殖率,评价材料细胞毒性;通过DPMT表面接种HUVECs体外共培养3d后,行活死细胞染色评价其体外细胞相容性.采用SPF级雄性SD大鼠建立DPMT大鼠背部皮下植入模型,于植入3、7、14、28 d取材,大体观察材料降解情况,并测量其横径;行HE染色和CD31免疫组织化学染色观察其生物相容性和血管新生情况.结果 匀浆-球磨-去垢剂多步骤脱细胞方法操作简便,制备DPMT仅需ld时间;检测显示DPMT脱细胞、脱脂完全,主要成分为Ⅰ型胶原及Ⅳ型胶原;DPMT中DNA含量为(15.902±1.392) ng/mg干重,总蛋白质含量占其干重的68.94％,显著低于新鲜猪骨骼肌组织[分别为(140.724±10.422) ng/mg干重及93.14％] (P＜0.05);DPMT内部呈均质疏松网状结构.体外细胞相容性实验显示DPMT细胞毒性评级均为0～1级,HUVECs在DPMT表面能稳定生长.DPMT大鼠皮下植入后14 d内可保持大体结构的稳定性,至28 d时完全降解;炎性反应在3d时明显,7d时明显减轻,两时间点炎性细胞数量比较差异有统计学意义(P＜0.05);植入后7d即可见DPMT内部新生血管环结构形成,14 d时新生血管环数量显著增加,比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 匀浆-球磨-去垢剂多步骤脱细胞方案省时高效、可重复性佳,所制备的DPMT脱细胞、脱脂完全,蛋白质成分保存良好,具有良好的体内外生物相容性,且可能具有一定诱导血管新生潜能.
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骨骼肌无细胞基质的制备及其生物相容性研究
目的 细胞外基质是脂肪组织工程材料的研究热点之一.通过探讨骨骼肌无细胞基质的制作方法及生物相容性,为其在脂肪组织工程中的应用奠定基础. 方法 取健康成年小香猪新鲜骨骼肌组织,横切成厚2～3mm的组织块,采用低渗-去垢剂法脱细胞处理.处理后采用HE染色、Masson三色染色、免疫组织化学染色及扫描电镜检测骨骼肌无细胞基质是否有细胞成分残留,并观察其基本结构；应用MTT法检测骨骼肌无细胞基质细胞毒性.取乳腺癌患者自愿捐赠脂肪组织,分离培养人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs),从形态学、流式细胞学和成脂、成骨分化能力方面进行鉴定.将骨骼肌无细胞基质与第3代hADSCs共培养,于培养后第1、3、5、7天通过细胞活性检测材料上细胞黏附、扩散和增殖情况,了解其与细胞之间的相互作用. 结果 HE、Masson、免疫组织化学染色及扫描电镜观察显示骨骼肌无细胞基质肌纤维去除完全,无细胞核残留,基质结构保留完整;大量连接成网状的胶原纤维呈多孔隙样结构,规则排列.MTT检测示骨骼肌无细胞基质细胞毒性为1级,细胞相容性好.细胞活性检测示hADSCs在骨骼肌无细胞基质上能很好地伸展,且能与周围基质黏附,进入基质内部并相互交织. 结论 经脱细胞处理的骨骼肌无细胞基质具有良好生物相容性,可能作为脂肪组织工程的支架材料.
