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不同来源金黄色葡萄球菌Panton-Valentine杀白细胞素基因的表达及其与agrA表达相关性研究
目的 研究不同标本分离的金黄色葡萄球菌临床分离株Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的表达及与agrA表达的相关性.方法 收集2003年1月至2010年12月4家医院从临床各种标本中分离的金黄色葡萄球菌,所有菌株均为非重复株.采用普通PCR和DNA测序检测PVL基因.采用实时荧光定量PCR检测lukSmRNA和agrAmRNA的量.结果 经过PCR扩增及测序共筛检出96株PVL阳性的金黄色葡萄球菌,其中58株为医院获得株,28株为社区获得株,10株由于临床资料不全不能区分；54株分离自血液标本,33株分离自脓液标本及9株分离自痰液标本；67株分离自成人的临床标本,29株分离自儿童的临床标本.分离自脓液标本和血液标本的菌株lukSmRNA的相对表达量的中位数分别为1.500和0.818,分离自脓液标本菌株的lukSmRNA的表达量明显高于分离自血液标本菌株的量(U=634,P=0.025)；分离自儿童和成人的菌株lukSmRNA的相对表达量的中位数分别为1.292和0.540,儿童分离株的lukSmRNA的表达量明显高于成人分离株的量(U=660,P=0.013);社区分离株和医院分离株lukSmRNA的相对表达量的中位数分别为1.034和0.536,社区获得株的lukSmRNA的表达量明显高于医院获得株的量(U=338,P=0.012).在总的分离株中,lukSmRNA与agrAmRNA的表达量存在正相关性(r=0.592,P＜0.01)；分离自脓液标本菌株的lukSmRNA与agrAmRNA相关系数较高(r=0.810,P ＜0.01),但分离自血液标本菌株的两者相关性系数较低(r=0.543,P ＜0.01).分离自儿童标本菌株的lukSmRNA与agrAmRNA量之间相关性更高,为0.804(P＜0.01),而分离自成人标本菌株的两者相关系数为0.476 (P＜0.01).社区获得株与医院获得株两者的相关系数分别为0.767(P＜0.0l)和0.556(P ＜0.01).结论 不同的感染类型lukS/F-PV基因的表达不同,agr系统可能对lukS/F-PV基因的表达具有正调节作用,尤其是在脓液和儿童分离株中发挥重要调节作用.(中华检验医学杂志,2013,36:313-317)
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信号系统在大鼠肺部铜绿假单胞菌感染中的作用及与致病因子的关系
目的研究密度感应信号系统(QS)在铜绿假单胞菌(PA)致大鼠肺部感染中的作用.方法将PA制成PA藻酸盐包裹体,建立大鼠肺部感染模型,SD大鼠258只,随机分为3组;比较野生型PA菌株PAO1及QS基因缺失的PA变异株PAO1-JP2大鼠肺部感染模型中细菌学、病理学的不同,从而评价2株菌在大鼠肺部感染中的致病性差异.用刚果红法测定该2株细菌弹性蛋白酶的活性;用免疫印迹法检测外毒素A的表达.结果感染后第14天、28天,PAO1-JP2肺组织匀浆菌落计数分别为(9.6±3.3)lgCFU/g及(4.2±3.1)lgCFU/g,显著低于PAO1组的(11.3±2.8)lgCFU/g及(9.1±1.5)lgCFU/g(P＜0.05).感染后第7、14及28天,PAO1-JP2感染组大鼠肺部病理变化指数及肺组织大体病理评分、肺部脓肿/肉芽肿的平均直径及肺组织显微病理评分均显著低于PAO1组.体外实验结果表明,PAO1-JP2菌株弹性蛋白酶活性(吸光度值)为0.35±0.03,高于PAO1菌株的0.02±0.00.免疫印迹实验可见PAO1株在相对分子质量73 000处显示棕色条带,PAO1-JP2株未见棕色条带.结论QS系统缺损后由于某些致病因子如弹性蛋白酶、外毒素不能表达,其导致的肺部感染程度有所减低.
关键词： 密度感应信号系统 假单胞菌 铜绿 N-乙酰基同型丝氨酸内酯 外毒素类 -
缓症链球菌外毒素的致病性研究
目的 从中毒性休克综合征爆发流行现场获取的病原菌，进行增菌培养，从病原菌分泌物中分离、纯化外毒素蛋白，以对其致病性进行实验研究。方法 将现场分离的缓症链球菌增菌培养后，所得上清液分别经20%、40%、60%、80% 硫酸铵盐析，进一步经快速蛋白液相色谱系统（FPLC）终纯化，分别皮下注射新西兰兔，观察有否发热。引起新西兰兔对大肠杆菌内毒素致死性休克的敏感性实验：先给实验组新西兰兔皮下注射纯化的链球菌外毒素10 μg，4 h后静脉注射10 μg大肠杆菌内毒素，对照组仅注射10 μg大肠杆菌内毒素。结果 经FPLC终纯化的20%硫酸铵盐析蛋白（分子量34 000）有致热性，可使新西兰兔平均体温升高1℃左右，病理见脾脏有丝分裂增加。纯化的链球菌外毒素可增加新西兰兔对大肠杆菌内毒素致死性休克的敏感性：实验组动物出现休克的临床表现，分别于16～29 h内死亡；而仅注射10 μg大肠杆菌内毒素的对照组动物无上述表现。结论 缓症链球菌外毒素蛋白是一种新的链球菌致热性外毒素。
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毒素蛋白PE40的基因克隆及序列分析
细胞因子-受体介导的靶向杀伤作为导向治疗白血病与肿瘤的第二代新策略,是现代分子导向药物研究的新领域之一.它是利用细胞因子与其受体的特异性结合来导向传递重组细胞因子-细菌外毒素融合蛋白以达到特异性杀伤高表达相应细胞因子受体的白血病及肿瘤细胞[1～3].从理论上讲,它比以抗原-抗体为主体的第一代导向杀伤策略具有更突出的优势,诸如导向的特异性更高、杀伤性更强、毒副作用更小、费用更低,既克服了耐药性的发生又不会导致继发性肿瘤,从而可避免或弥补放、化疗及造血干细胞移植的诸多缺陷或弊端.
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新型重组免疫抑制蛋白B7-2-L-PE40KDEL的分子构建与生物活性及结构特性
目的构建重组B7-2-L-PE40KDEL融合蛋白,特异性杀伤CD28高表达的T细胞,选择性阻断T淋巴细胞活化过程中的B7:CD28/CTLA-4共刺激信号系统,由此诱导免疫耐受,特异性防治移植物抗宿主疾病(GVHD)和宿主抗移植物疾病(HVGD).方法采用基因融合序列重叠延伸(SOE)策略,构建新型重组pRSETA-B7-2-L-PE40KDEL外毒素融合蛋白的原核表达载体,实现融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,利用亲和层析等方法进行蛋白质纯化.对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性等进行模拟分析.采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD28受体的T细胞的活性进行测定.结果构建并高效表达了B7-2-L-PE40KDEL融合蛋白,所获融合蛋白的纯度大于95% .该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,其柔性及抗原性、亲水性表位均未显著改变.活性测定显示,该重组融合蛋白能有效特异性地杀伤高表达CD28的人T淋巴瘤细胞系,而对未表达CD28的人白血病细胞系则无任何杀伤.结论具有靶向性免疫抑制活性的新型重组B7-2-L-PE40KDEL外毒素融合蛋白的构建、表达对特异性防治GVHD和HVGD可能产生积极的影响.
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白细胞介素13介导铜绿假单胞菌外毒素靶向性治疗胶质瘤的体外观察
目的 观察以白细胞介素(IL) 13与铜绿假单胞菌外毒素为基础构建的融合毒素(IL-13PE38)对实体恶性胶质瘤细胞的杀伤作用,分析其效能与恶性胶质瘤细胞表面IL-13α2受体(IL-13Rα2)表达强度的关系.方法 对2009年6月至2010年12月温州医学院附属第一医院手术治疗的10例间变型胶质瘤和11例胶质母细胞瘤手术切除新鲜标本,在进行肿瘤细胞的原代培养时加入IL-13PE38并进行细胞MTS代谢率测定同时计算细胞存活率(SR)；采用免疫组织化学ABC法并利用图像分析系统检测IL-13Rα2在恶性胶质瘤表达的积分光密度(IOD),以IOD值代表其表达强度,对恶性胶质瘤的细胞存活率与IL-13Rα2的表达强度做相关性分析.结果 (1)21例标本有19例(90％)存在IL-13Rα2的强阳性表达,胶质母细胞瘤中的表达强度高于间变型胶质瘤(P＜0.05).(2)恶性胶质瘤细胞原代培养时加入IL-13PE38后细胞存活数有不同程度的减少,其中有14例细胞存活率低于70％,9例低于50％；在加入同浓度的IL-13PF38后间变型胶质瘤细胞存活率高于胶质母细胞瘤(P＜0.05).(3)恶性胶质瘤IL-13Rα2的表达强度和细胞存活率呈高度负相关(r=-0.093,P＜0.01).结论 低浓度的IL-13PE38对实体恶性胶质瘤细胞的有明显的杀伤作用；其杀伤效能的大小取决于恶性胶质瘤细胞表面IL-13 Rα2的表达强度.
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利多卡因对金黄色葡萄球菌外毒素TSST-1刺激的特应性皮炎患者外周血单一核细胞的影响
目的 探讨利多卡因对金黄色葡萄球菌外毒素激活特应性皮炎患者单一核细胞的影响.方法 抽取6例特应性皮炎患者外周血,常规分离培养单一核细胞.以金黄色葡萄球菌外毒素刺激共孵育,同时加入不同浓度的利多卡因.3H-TdR掺入法检测单一核细胞增殖,酶联免疫吸附法(ELISA)检测Th1和Th2细胞因子的释放.Western印迹法检测利多卡因对与中毒性休克综合征毒素1(TSST-1)刺激的特应性皮炎患者单一核细胞共孵育的HaCaT细胞中间丝相关蛋白的表达.结果 TSST-1(100 μg/L)显著刺激了特应性皮炎患者单一核细胞的增殖(SI=75±2.12,P＜0.05),并刺激α肿瘤坏死因子、γ干扰素、白细胞介素(IL)2、IL-12、IL-4、IL-5、IL-13细胞因子的释放(均P＜0.05).CCK-8检测结果显示,与空白对照组相比,100 μmol/L利多卡因显著抑制了TSST-1刺激的特应性皮炎患者单一核细胞的增殖(SI=58±3.14,P＜0.05),亦显著抑制了TSST-1刺激的特应性皮炎患者外周血IL-4、IL-5、IL-13、α肿瘤坏死因子以及γ干扰素的释放,差异有统计学意义(均P＜ 0.05).Western印迹法结果显示,100 μmol/L利多卡因阻断了HaCaT细胞中间丝相关蛋白表达的下调,差异有统计学意义(P＜ 0.01).结论 利多卡因对TSST-1刺激的特应性皮炎患者单一核细胞的激活具有明显的抑制作用.
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特应性皮炎患儿皮损局部金黄色葡萄球菌外毒素检测
目的了解特应性皮炎(AD)患儿皮损局部金黄色葡萄球菌(金葡菌)的带菌率及其分泌外毒素的情况,探讨金葡菌及其分泌的外毒素在AD发病中的作用.方法AD皮损局部分离金葡菌,反向被动乳胶试验方法检测其外毒素表达,并与对照组进行统计学比较.结果与对照组相比,AD患儿无论是皮损局部还是非皮损区金葡菌带菌率明显升高(P值均＜0.01),且与疾病严重性呈正相关性(P＜0.01).但AD皮损局部的金葡菌与对照组金葡菌相比,两者分泌外毒素的情况差异无显著性(P＞0.05),并且皮损局部的金葡菌是否分泌外毒素与疾病严重性无直接相关性(P＞0.05),但伴有血清总IgE水平升高的AD患儿,疾病相对较重(P＜0.01).结论AD患儿皮损区金葡菌带菌率为43.24%,其中47.46%分泌外毒素,以金葡菌肠毒素B(SEB)常见.
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A组溶血性链球菌致病因子SpeB研究进展
A组溶血性链球菌是一种常见的致病性化脓链球菌,近年来由于链球菌导致的疾病发生及侵袭性感染不断增多,其耐药性不断增强,该病原体逐渐引起研究者们的重视.链球菌的致病性和其所携带的致病因子密切相关,目前已发现多种链球菌致病因子,包括表膜蛋白、链球菌溶血素,透明质酸酶、致热外毒素、链激酶及DNA酶等.其中,链球菌发热性外毒素SpeB是目前研究比较多的一种致病因子,其在穿越宿主免疫屏障、破坏血凝系统、引起炎症反应、逃避免疫系统并引起免疫交叉反应中起重要作用,本文就SpeB的新研究进展进行综述.
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重组TGFa-PF40对动脉球囊损伤后内膜增生的抑制作用
目的：探讨基因重组转化生长因子α-绿脓杆菌外毒素融合蛋白(TGFα-PFA0；TP40)对动脉球囊损伤后内膜增生的抑制作用.方法：40只雄性兔随机分为TP40 15μg、30μg、60μg、正常动脉及生理盐水对照组(n=8)，均高脂饲养.在兔右颈总动脉行球囊内膜剥脱术后24 h，治疗组于动脉损伤段局部给予TP40 15μg、30μg及60μg治疗；对照组给予生理盐水.正常动脉组局部给予TP40 60μg.于治疗后第2周取实验动脉段行光镜、电镜观察及计算机图像分析.结果：光镜观察见对照组动脉内膜不规则增厚，新生内膜可见大量平滑肌细胞(SMC)，管腔狭窄；TP40治疗组动脉内膜增生被明显抑制，管腔无狭窄；TP40对正常动脉影响不大；电镜观察见TP40 60μg治疗组的动脉中膜有较多变性、坏死的SMC；计算机图像分析显示动脉损伤后第2周TP40治疗组内膜截面积及内膜与中膜截面积的比值显著小于生理盐水对照组(P＜0.01).结论：TP40对动脉球囊损伤后的内膜增生具有抑制作用.
