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国内首例播散性毛孢子菌病患者的救治与护理
2000年4～10月我院收治一例播散性毛孢子菌病患者,该病是一种由酵母样真菌-阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii.)所致的系统感染性真菌病.国外虽有毛孢子菌皮肤感染的个例报道,但均继发于白血病或肿瘤基础上,且患者均死亡.[1]动物实验模型中可见由该菌感染内脏器官的报道, 本例系统播散性感染患者及其致病菌均为我国首次发现,[2,3]临床救治获得成功, 现将其综合护理情况报告如下.
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侵袭性肺阿萨希毛孢子菌病并肺泡蛋白沉着症一例及文献复习
目的：探讨肺部侵袭性毛孢子菌病并肺泡蛋白沉着症的临床特点和治疗方案。方法对1例患有肺部侵袭性毛孢子菌病并尘肺肺泡蛋白沉着症50岁石雕工人的临床资料进行总结和分析及文献资料进行复习。结果患者因反复咳嗽、咳痰、发热、气促20余天入院，因严重呼吸困难，予气管插管呼吸机辅助通气，CT提示进行性增多的双肺弥漫性磨玻璃状阴影，部分融合，双肺弥漫性小结节状密度增高影，肺间隔明显增厚，纵隔淋巴结肿大并钙化，双侧胸腔少量积液。右肺上中叶灌洗液呈均匀血性，双下肺灌洗液呈棕黄色奶状，静置分层。灌洗液多次培养出阿萨希毛孢子菌。右下肺基底段经支气管肺活检（TBLB）考虑尘肺并肺泡蛋白沉着症。两性霉素B脂质体抗真菌，入院后第3天体温下降，第6天经纤支镜下予右肺下叶1000 ml生理盐水，局部肺泡灌洗，氧合进行性改善，入院后7 d拔除气管插管导管，28 d后复查纤支镜检查，并在右肺中叶及左舌叶分别行灌洗，灌洗液呈白色浑浊状，培养结果均未发现致病菌，50 d复查胸部CT双肺病灶明显吸收，停抗真菌和激素好转出院，随访过程中预后良好。结论肺部毛孢子菌感染为临床少见病，肺部侵袭性毛孢子菌病并肺泡蛋白沉着症更为少见，积极病理学、病原学诊断，合理抗真菌和肺泡灌洗治疗有助于早期拔除气管插管，改善预后。
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骨折患者侵袭性阿萨希毛孢子菌致重症感染l例
临床资料患者女性,69岁,行走时不慎扭伤左踝关节,行X-ray检查:左内外踝关节骨折,骨折线移位明显,距骨向外脱位,术前诊断为左双踝骨折,入院后做左双踝骨折内固定术.既往2001年有脑梗塞病史,5年前鼻咽癌手术并术后口鼻相通,饭后须以药物冲洗,有反复感染史.术后第6天患者出现咳嗽,咳痰伴喘息,诊断为"肺感染".次日进食后昏迷,呼吸窘迫,双肺呼吸音粗,闻及湿哕音,考虑误吸导致"急性呼吸衰竭",窒息可能性大,急行气管插管吸出牛奶及食物残渣.血常规,白细胞12.48×109/L,中性粒细胞88.2%.
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阿萨希毛孢子菌体外 H2O2抗氧化诱导及生物学特性研究
目的：研究体外能否用 H2 O2诱导阿萨希毛孢子菌（T ．asahii）产生抗氧化性及诱导获得的抗氧化株的稳定性，并观察诱导过程中菌株的形态、药物敏感性的变化。方法将 T ．asahii CBS2479、CBS8904在 H2 O2浓度逐渐梯级倍增的Y PD液体培养基中传代，直至无法诱导为止；将终末代菌株在不含H2 O2的Y PD液体培养基中连续传10代；观察诱导和回复过程中菌株的酶学、药敏值、形态学变化。结果 CBS2479诱导前CAT 值46．89 U／mprot ，诱导后、回复后分别为（133．00±16．97）、（89．78±22．90）U／mprot ；诱导前SOD值178．54 U／mprot ，诱导后、回复后分别为（534．42±201．91）、（668．78±61．45） U／mprot ；CBS8904诱导前CAT 值44．06 U／mprot ，诱导后、回复后分别为（121．17±2．21）、（80．62±23．19）U／mprot ；诱导前SOD值226．70 U／mprot ，诱导后、回复后分别为（569．64±72．52）、（514．12±79．00）U／mprot ；诱导末期的菌株对氟康唑和 H2 O2的MIC值为诱导前M IC值的2倍；光镜下可见CBS2479、CBS8904分别由诱导前的菌丝状、孢子状变为诱导后呈假菌丝与孢子混合状态。结论利用浓度梯级倍增的H2 O2能够诱导出抗氧化的 T ．asahii菌株，且抗氧化能力相对稳定；诱导后菌株对氟康唑和 H2 O2的耐受力提高，是光镜形态发生变换，出现假菌丝与孢子混合状态。
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从一患者胆汁中分离出1株阿萨希毛孢子菌
阿萨希毛孢子菌系毛孢子菌属中的一种,为酵母样真菌.随着激素免疫抑制剂、抗菌药物等的应用,条件致病真菌感染的数量日益增多,近来发现阿萨希毛孢子菌是皮肤、呼吸道和胃肠道的免疫受损患者和新生儿的条件致病菌.本例导致肝胆系统损害,现报道如下.
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阿萨希毛孢子菌感染两例
阿萨希毛孢子菌引起的感染较少见,我们从患者标本中检出阿萨希毛孢子菌两例,现报道如下.1病例1.1 病例1 患者男,83岁,因咳嗽咳痰间断发热1个月于2009年4月13日入院,既往有2型糖尿病、冠心病等病史.全身皮肤多处有浸润性暗红色斑片,有3处4 cm×4 cm大小的黑斑,时有糜烂结痂.实验室检查:尿常规RBC 5/μl,有真菌孢子及菌丝.取尿样接种于血、萨布罗和麦康凯琼脂平板,35℃需氧培养,24 h均有两种菌落生长,菌落计数＞10 5CFU/ml.涂片为革兰阳性关节孢子及细长菌丝,血清芽管阴性,尿素酶阳性.取菌加入API20CAUX试剂条中,30℃孵育48 h,提示为阿萨希毛孢子菌.其后又多次从该患者尿、皮损分泌物中培养出该菌.APIFUNGUS2系统MIC值48 h:氟康唑8μg/ml、5-氟胞嘧啶32 μg/ml、两性霉素B0.5 μg/ml、伊曲康唑0.5μg/ml.
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国内临床分离阿萨希毛孢子菌3个新基因型分析
目的 通过对IGS1区基因序列分析,明确国内临床分离8株阿萨希毛孢子菌(T.asahii)的基因型,为T.asahii感染的流行病学研究提供依据.方法 以国内不同地区、不同患者临床分离的8株T.asahii为研究对象,PCR扩增、克隆IGS1区,寻找基因突变位点,构建系统发生树,明确国内T.asahii的基因型.结果 IGSI区长度均为643 bp,部分菌株碱基发生突变;8株T.asahii共发现5个基因型,其中3株为国际上首次发现的新基因型,分别命名为基因型10(BZ702)、11(BZ704)、12(BZ901),3株为基因型I(BZ701、BZ705、BZ706),2株为基因型4(BZ703、BZ902).结论 中国的T.asahii菌株具有不同于其他国家的多种基因型,种内多样性更丰富,这可能与中国地域广阔有关,为T.asahii感染的流行病学研究提供了依据.
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中国首株阿萨希毛孢子菌环境株的分离及其发育形态研究
目的 从土壤环境中分离阿萨希毛孢子菌环境株,并对其发育形态进行研究,为进一步研究致病性和耐药性等方面的差异奠定基础.方法 在每年的5-9月重庆地区取材,分别应用二氯硝基苯胺玫红氯霉素(DRBC)及酵母麦芽(YM)培养基进行培养,分离出的菌株分别接种于3％尿素酶培养基进行脲酶试验、形态观察,API20和ITS片段扩增等方法进行逐级分离鉴定,观察环境株与临床株(阿萨希毛孢子菌1株,标准菌株号:CBS2479)在发育形态上的差异.结果 从106份土壤样本中成功分离鉴定出1株阿萨希毛孢子菌环境株,肉眼形态:菌落呈灰白色,表面干燥呈粉末状,未见沟回,形态呈圆形,边缘光滑;光镜形态:以链状孢子为主,有少许关节孢子及分生孢子;电镜下形态:孢子呈饱满的圆形或圆柱形,表面可见绒毛样物质和蛋白样物质,孢子间有丝状物质相接,这些形态特点与临床株差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 成功从土壤中分离出中国首株阿萨希毛孢子菌环境株,并发现其在发育形态上与临床株有显著性差异.
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阿萨希毛孢子菌rRNA区域多态性研究分析
目的 通过对国内临床分离5株阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)rRNA基因3个不同区域的RFLP分析,明确T.asahii是否具有种内基因多态性以及D1/D2、ITS、IGS1区在T.asahii基因多态性研究中的作用.方法 提取T.asahii DNA,用特异引物PCR扩增D1/D2、ITS及IGSI区,分别用限制性内切酶HapⅡ、Mbo Ⅰ、Alu Ⅰ和Hha Ⅰ对3个区域的PCR产物进行酶切、分析.结果 D1/D2、ITS区酶切结果在菌株间无差异;IGS1区HapⅡ酶切菌株BZP07003结果及Hha Ⅰ酶切菌株BZP07004结果与其他菌株不同.结论 国内临床分离T.asahii具有种内基因多态性,在rRNA基因3个不同的区域中,IGS1区可用于丁.asahii基因多态性的研究分析.
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纳米银对阿萨希毛孢子菌抑菌效果及作用机制的研究
目的：明确并评价纳米银对阿萨希毛孢子菌的抑菌效果，探讨其可能的作用机制，为寻找新的抗真菌药物提供理论依据。方法观察不同浓度纳米银在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA ）上阿萨希毛孢子菌的生长情况，用M‐27标准方案测定其M IC值，透射及扫描电镜下观察纳米银对阿萨希毛孢子菌超微结构的影响。结果发现纳米银对阿萨希毛孢子菌具有明显的抑制作用，且与浓度呈正相关，菌落直径为0～5．5 cm ；其M IC值为0．5μg／ml，大于伏立康唑的0．03～0．06μg／ml，小于其他常用抗真菌药物；电镜下发现，纳米银对其细胞壁及细胞膜均有不同程度的破坏，对线粒体、染色质、核糖体等细胞器结构的破坏也非常明显。结论纳米银对阿萨希毛孢子菌生长具有明显抑制作用，其抗菌效果好于常用的抗真菌药物，其作用机制可能为通过对细胞壁、细胞膜的破坏或者直接渗透入细胞内，引起细胞内容物外泄及细胞器的损伤，终可导致细胞死亡。
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造血干细胞移植患儿感染播散性阿萨希毛孢子菌的护理
目的：探讨造血干细胞移植患儿发生播散性阿萨希毛孢子菌感染的预防和防护措施，为临床治疗提供参考依据。方法调查分析2012年1月1例7岁女性再生障碍性贫血患儿在行造血干细胞移植过程中发生阿萨希毛孢子菌和白色假丝酵母菌感染临床资料及护理措施效果。结果该例重型再生障碍性贫血患儿移植前长期应用激素、环孢素等免疫抑制剂，移植后第7天，患儿处于粒细胞缺乏期，出现高热、感染性休克症状，4次血培养均见阿萨希毛孢子菌和白色假丝酵母菌，诊断阿萨希毛孢子菌和白色假丝酵母菌败血症，经过伏立康唑、两性霉素B联合抗真菌治疗和精心护理，患儿体温正常，血像、骨髓像逐渐恢复。结论有针对性的护理措施和有效的治疗方法是救治造血干细胞移植过程中并发播散性阿萨希毛孢子菌感染成功的关键。
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阿萨希毛孢子菌顶体观察
目的 了解阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)菌丝生长与顶体(spitzenk(o)rper)的关系.方法 用荧光染剂FM4-64对YPD液体培养基培养后的T.asahii进行荧光染色,经不同浓度细胞松弛素D抑制后,在荧光显微镜下观察染色结果.结果 在T.asahii芽胞、芽管以及菌丝顶端和亚顶端均可见到FM4-64荧光聚集；随着细胞松弛素D浓度的增加,其顶体荧光逐渐消失.T.asahii的生长受到明显抑制.结论 T.asahii存在与真菌极性生长密切相关的顶体,其在控制菌丝生长方面起着重要的作用.
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重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对人THP-1单核细胞抗阿萨希毛孢子菌活性增强作用的研究
目的 研究重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rh GM-CSF)对单核细胞吞噬、杀伤阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)功能的影响.方法 不同浓度的rh GM-CSF(100 U/ml、200 U/ml及400U/ml)与人THP-1单核细胞预孵育48 h后,加入T.asahii临床株共培养1 h,应用瑞氏-姬姆萨染色,倒置显微镜下观察人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬情况;菌落计数法评估人THP-1单核细胞对T.asahii的杀伤情况.结果 rh GM-CSF预孵育可使人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬率从20％ 提高到84％ 左右.人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬率随rh GM-CSF浓度增高而升高,具有浓度依赖性.200 U/ml及400 U/ml的rh GM-CSF预孵育组,每毫升T.asahii菌落形成单位较对照组明显减少(P<0.05).结论 rh GM-CSF可明显增强人THP-1单核细胞对T.asahii的吞噬、杀伤活性.
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白细胞介素10和转化生长因子β1在播散性毛孢子菌病小鼠模型中的动态研究
目的：观察播散性毛孢子菌病小鼠模型中白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子β1（TGF-β1）的动态表达，并探讨其在播散性毛孢子菌病中可能发挥的作用。方法50只雄性BALB/c小鼠随机分为试验组和对照组，每组25只，尾静脉分别接种阿萨希毛孢子菌（T.asahii）悬液和生理盐水，接种后3 d、7 d、14 d、21 d及28 d，对小鼠肾脏载菌量进行测定；取小鼠内眦静脉血，离心获得血清，通过双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测两组小鼠不同感染时间血清IL-10和TGF-β1表达水平；实时荧光定量PCR检测两组小鼠不同感染时间脾脏IL-10 mRNA和TGF-β1 mRNA表达情况；采用Pearson相关分析对试验组小鼠不同感染时间肾脏载菌量与血清IL-10、TGF-β1、脾脏IL-10 mRNA、TGF-β1 mRNA表达量及试验组小鼠血清IL-10表达水平与脾脏IL-10 mRNA表达量、血清TGF-β1表达水平与脾脏TGF-β1 mRNA表达量进行相关分析。结果接种后3 d，试验组小鼠肾脏载菌量为（69.5±9.1）cfu/mg，接种后7 d，小鼠肾脏载菌量达到峰值，为（120.3±11.4） cfu/mg，其后载菌量逐渐降低，接种后28 d为（2.0±2.5）cfu/mg。试验组小鼠血清IL-10与TGF-β1表达水平在7 d较对照组明显升高，14 d时达到峰值，随后逐渐降低。接种后7 d、14 d、21 d，小鼠血清IL-10表达水平与对照组相比，差异有统计学意义（P均＜0.05）。接种后7 d、14 d、21 d，小鼠血清TGF-β1表达水平与对照组相比，差异有统计学意义（P均＜0.05）。试验组小鼠脾脏IL-10 mRNA、TGF-β1 mRNA表达量在7 d逐渐增高，14 d时达到峰值，随后逐渐降低至对照组水平。接种后7 d、14 d、21 d，小鼠脾脏IL-10 mRNA、TGF-β1 mRNA表达量与对照组相比，差异有统计学意义（P均＜0.05）。试验组小鼠血清IL-10表达水平与脾脏IL-10mRNA、血清TGF-β1表达水平与脾脏TGF-β1 mRNA表达量均呈明显正相关（P均＜0.05）。接种后7 d、14 d、21 d，试验组小鼠肾脏载菌量与血清IL-10、TGF-β1表达水平及脾脏IL-10 mRNA、TGF-β1 mRNA表达量均呈明显正相关（P均＜0.05），而接种后3 d和28 d，试验组小鼠肾脏载菌量与血清IL-10、TGF-β1表达水平及脾脏IL-10 mRNA、TGF-β1 mRNA表达量均无明显相关性（P＞0.05）。结论IL-10和TGF-β1可能参与了小鼠播散性毛孢子菌感染后的免疫应答反应，且表现为先增高后逐渐下降的趋势，可能减弱了机体清除T.asahii的能力，为T.asahii的存活提供了有利条件。
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阿萨希毛孢子菌对氧化剂敏感性的实验研究
目的 观察两种氧化剂对阿萨希毛孢子菌(T.asahii)临床分离株与环境分离株生长发育的影响.方法 临床分离株与环境分离株菌悬液分别接种于加入了不同浓度的过氧化氢和甲萘醌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)与酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基(YPD液体培养基)中,肉眼、光镜及电镜下观察菌株的形态变化.结果 ①肉眼形态,随氧化剂浓度的升高,菌落直径逐渐缩小,当达到一定浓度时,菌落不再生长；相同条件下,环境分离株较临床分离株菌落直径小；②光镜形态,菌落发育延迟,数量减少,见许多芽管,随氧化剂浓度的升高,出现许多不易着色、发育不全的孢子,体积较小,偶见胞质萎缩的稍大孢子；③电镜形态,两种氧化剂对两株菌均有损伤,可见菌体表面皱缩,胞壁部分至完全破损,胞质溢出,菌株体积缩小.结论 两种氧化剂对两株菌生长发育均有影响,呈浓度依赖,但甲萘醌对菌株影响更强；环境分离株受氧化剂影响更大.
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干扰素-γ增强RAW264.7巨噬细胞对阿萨希毛孢子菌杀伤作用的机制研究
目的 探讨干扰素-γ (IFN-γ)对RAW264.7巨噬细胞(Macrophage,Mφ)体外抗阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,Tasahii)杀伤作用的机制.方法 不同浓度(10、100、1000U/ml)的IFN-γ与RAW 264.7共同培养,再加入阿萨希毛孢子菌培养后检测菌落形成单位(CFU/ml),计算各生长抑制率.在上述体系上清液中分别检测亚硝酸根离子(NO-2).将巨噬细胞与不同终浓度的IFN-γ共同孵育后,分别检测超氧阴离子(O-2)的OD值.结果 IFN-γ浓度分别为10、100、1000U/ml时,T.asahii的生长抑制率分别为25.21％、41.95％、55.83％,组间差异具有显著统计学意义(P＜ 0.01)；上清液中NO-2的浓度分别为89.16±3.32、108.07±3.81、126.44±3.52,与空白对照组( 74.47±1.48)相比差异具有显著性意义(P＜0.01)；上清液中O-2的OD值分别为0.317±0.006、0.424±0.006、0.518±0.006,与对照组相比差异具有显著性意义(P＜0.01).结论 随着IFN-γ浓度的增加,T.asahii生长抑制率增加.IFN-γ通过增强Mφ产生一氧化氮(NO)及超氧阴离子(O-2)来发挥体外抗T.asahii的杀伤作用.
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阿萨希毛孢子菌胞外分泌酶水平的比较
目的 探索阿萨希毛孢子菌细胞外分泌酶的种类与活性.方法 采用卵黄琼脂培养基、BSA-琼脂培养基和AIP-ZYM试剂盒,观察11株阿萨希毛孢子菌细胞外分泌酶的种类及酶活性.结果 11株阿萨希毛孢子菌中9株磷脂酶活性较强,2株酶活性弱；均未测得酸性蛋白酶分泌.AIP-ZYM试剂盒显示11株菌有共性分泌酶,也有部分菌株有特异性分泌酶.结论 阿萨希毛孢子菌细胞外分泌酶种类多样,不同来源菌株产酶种类及酶活性亦不相同.
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结合珠蛋白在阿萨希毛孢子菌小鼠皮肤感染中的表达与调控
目的 探讨结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)在阿萨希毛孢予菌皮肤感染过程中的免疫调节作用.方法 80只BALB/c小鼠分为免疫抑制组和非免疫抑制组,两组小鼠皮下均接种3.2×107cfu/ml的阿萨希毛孢子菌菌悬液,分别于接种后0.5d、1d、3d、5d处死小鼠,取皮损组织,提取总RNA,RT-PCR检测tJHp mRNA表达,基因芯片技术研究免疫相关基冈差异表达.结果 两组小鼠在第0.5d、1d、3d、5d后皮损组织均扩增出Hp mRNA,其中免疫抑制组皮损组织Hp mRNA表达水平明显高于非免疫抑制对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01).免疫抑制组感染1d后皮损组织Hp mRNA表达明显高于0.5d、3d、5d,组间比较均有显著性差异(p<0.01).筛选出的11条免疫相关差异表达基因中编码结合珠蛋白基凶表达上调.结论 结合珠蛋白参与了皮肤阿萨希毛孢子菌感染的过程.
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不同来源阿萨希毛孢子菌菌丝相体外诱导条件的探讨
目的 探讨在不同诱导因素条件下,不同来源的阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)菌丝诱导结果的差异.方法 11株不同来源的T.asahii,选用RPMI-1640液体培养基、YPD液体培养基、吐温酵母肉汤(TYB)培养基和50%(v/v)胎牛血清,分别在15℃、25℃和37℃条件下培养,于1h、2h、3h、6h、12 h、24 h计数菌丝生成率.结果 T.asahii 15℃菌丝生成率均值为(0.15±0.42)%,25℃为(5.75±3.48)%,37℃为(33.81±15-39)%,差异有统计学意义(P值均<0.05).RPMI-1640培养基诱导菌丝生成率均值为(46.24±25.50)%,YPD液体培养基为(36.28±21.85)%,TYB培养基为(33.93±21.29)%,50%(v/v)胎牛血清为(18.60±14.58)%,组间比较有显著统计学差异(F=6.29,P=0.0013),组内比较有显著统计学差异(F=21.80,P=0.0000).随着诱导时间的延长,各菌株菌丝生成率也随之上升.结论 综合比较各诱导因素,RPMI-1640培养基、37℃诱导24h可使大多数Zasahii菌株由孢子相获得较纯的菌丝相,而菌株来源的不同也是影响诱导结果差异的重要因素之一.
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阿萨希毛孢子菌脂筏的观察
目的 了解阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)菌丝生长脂筏(rapid lifts)的关系.方法 用荧光染剂Filipin对YPD液体培养基培养后的T.asahii进行荧光染色,在荧光显微镜下观察染色结果；在菌悬液中分别加入不同浓度的两性霉素B (0.2、0.5、1、2μg/L)进行干预并荧光染色,对比观察干预前后菌丝的生长变化.结果 T.asahii芽管、假菌丝以及菌丝顶端和分隔部位可见到Filipin荧光聚集；经不同浓度两性霉素B干预后,T.asahii生长受到不同程度的抑制,随着两性霉素B浓度的增加T.asahii的生长抑制越明显,顶端和隔膜部位荧光消失,而菌体内见散在荧光.结论 脂筏在调控T.asahii菌丝生长、分枝以及假菌丝继续出芽生长等方面起着重要的作用.
