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在校大学生隐形眼镜保存盒护理液内棘阿米巴复合PCR检测
目的 应用无营养琼脂培养法和复合PCR法检测隐形眼镜护理液中棘阿米巴,探讨配戴隐形眼镜与棘阿米巴角膜炎发病的关系. 方法 收集83名在校大学生隐形眼镜保存盒内使用过夜的护理液,应用无营养琼脂培养法和复合PCR法检查棘阿米巴污染情况,40份未使用的护理液作阴性对照. 结果 123份标本经无营养琼脂培养均为阴性.83份使用过夜的护理液复合PCR法检测1例阳性,其余82份均为阴性;40份阴性对照复合PCR法检测均为阴性. 结论 隐性眼镜保存盒内使用过夜的护理液有棘阿米巴原虫污染.
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复合聚合酶链反应鉴别龟甲正品与伪品的特征
目的 探讨复合聚合酶链反应(PCR)技术鉴别中药材龟甲真伪的分子标记特征.方法 采用盐析法提取龟甲正品及其伪品线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA).从GenBank数据库中下载乌龟mtDNA细胞色素b(cytochrome b,Cyt b)和细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome oxidase subunit Ⅰ,CoⅠ)的基因序列,用Premier 5.0设计2对特异性引物,建立复合PCR技术对龟甲正品及其伪品进行扩增并测序.结果 盐析法提取的龟甲mtDNA的大小均为16.6×103 bp,正品龟甲经复合PCR扩增在300～500 bp间有2条明亮分明的条带,而伪品龟甲只出现1条或无条带.结论 复合PCR技术鉴别龟甲真伪具有高度特异性、简便、准确、快捷、实用性强,对龟甲类药材的鉴定有很高的应用价值及准确性.
关键词： 龟甲 复合PCR 细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CoⅠ) 细胞色素b -
复合PCR技术在ABO血型基因分型中的应用
目的 探讨复合PCR技术在ABO血型基因分型方法中的应用.方法 通过实验研究摸索复合PCR的条件和规律,采用单管同时扩增出ABO基因的第6、7外显子后,使用限制性内切酶对复合PCR产物进行酶切消化.结果 通过佳实验反应条件的获得,可建立ABO血型基因分型方法.结论 复合PCR技术在建立ABO血型基因分型方法的应用中,具有其特殊性.
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伤寒和甲型副伤寒沙门菌复合PCR检测
目的 建立用于快速和特异检测伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的复合PCR方法.方法 根据rfbS、rfbE、fliC和vi基因序列设计4对PCR引物,对54株沙门菌和其他菌属的菌株进行复合PCR检测.结果 采用所建立的复合PCR方法可分别检测到伤寒和甲型副伤寒沙门菌的3条和2条特异性条带带型,可与其他菌株带型准确分开.结论 本研究建立的复合PCR方法可用于检测伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌.
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复合PCR检测老年人腹膜透出液中的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌
目的检测老年人腹膜透出液中的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌.方法应用复合PCR检测老年人未感染的及已感染的腹膜透出液,并与传统培养方法进行对比.结果在同一反应管中可同时检测金黄色葡萄球菌-DNA和白色念珠菌-DNA,分别出现279 bp、684 bp的特异性扩增带.结论复合PCR法与传统培养方法相比具有快速、特异、敏感的优点,老年人腹透液中白色念珠菌感染率明显增高.
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中缅边境(西段)传疟媒介的初步调查
目的 了解中缅边境(西段)传疟媒介的分布与构成.方法 2008年8～9月,在中缅边境的中国云南省盈江县及其相邻的缅甸昔懂县6个自然村,用诱蚊灯在人房和牛棚共进行20次通宵诱捕.将捕获的蚊虫以传统方法 进行形态学鉴定,然后用复合PCR法鉴别微小按蚊、乌头按蚊和杰普按蚊.同时,抽提部分蚊虫标本总基因组DNA,以巢式PCR方法 检测蚊体内的疟原虫感染情况.结果 共捕获各类蚊虫4 571只,隶属9属50种,其中按蚊属是优势蚊种,占总量的54.32%(2 483/4 571).人房和牛棚的按蚊蚊种构成差异有统计学意义,其中人房以腹簇按蚊、微小按蚊和中华按蚊为主,而牛棚以腹簇按蚊(223只)、环纹按蚊(184只)、迷走按蚊(131只)和杰普按蚊(129只)为主.对比有牛村和无牛村中人房的蚊种构成发现,有牛村的人房以微小按蚊(260只)和腹簇按蚊(49只)为主,而无牛村人房则以腹簇按蚊(481只)和中华按蚊(124只)为主.巢式PCR检测1 075只按蚊,其中9只检出疟原虫阳性,分别为微小按蚊(7/408)、乌头按蚊(1/125)和伪威氏按蚊(1/101).经测序鉴定均为恶性疟原虫感染,目的 条带长204 bp.结论 中缅边境(西段)蚊虫密度高、种类多,在传疟作用中以微小按蚊为重要,乌头按蚊和伪威氏按蚊亦为当地的传播媒介.
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用复合PCR检测炭疽芽孢的研究
目的建立同时检测炭疽芽孢杆菌两个毒力相关质粒基因的复合PCR技术,并用于模拟污染土壤中炭疽芽孢的检测.方法根据炭疽芽孢杆菌两个毒力相关质粒pX01和pX02上的水肿因子和荚膜基因设计引物,并探讨建立复合PCR同时扩增这两种基因的方法,评价其特异性和敏感性,并将炭疽芽孢杆菌疫苗株A16.R的芽孢加入土壤制备污染土壤,用复合PCR检测其中的芽孢,评价该方法的实用性.结果我们发现在影响复合PCR的条件中,不同引物的比例与浓度条件为关键;复合PCR检测的敏感性比单一基因PCR检测敏感性低10倍.用复合和单一PCR检测土壤中的炭疽芽孢表明,二者都能检测出0.25g土壤中的103个芽孢.结论我们建立的复合PCR能够特异敏感的检测土壤中的炭疽芽孢.
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5个STR基因座遗传多态性研究及复合扩增试剂盒的构建及应用
目的用分子克隆技术制备出D7S820、D13S317、D5S818、D3S1358等四个STR基因座和Amelogenin基因座的分型标准物,并建立用复合PCR进行同步扩增检测的方法,以提高检测效率,降低成本.方法用复合扩增方法检测130名云南省汉族和130名成都汉族无关个体的5个基因座的等位基因分布,五个基因座的各等位基因互不重叠,PCR复合扩增产物电泳分型清晰,与单基因座检测结果一致.结果D7S820、D13S317、D5S818、D3S1358四个STR基因座在两个汉族群体中的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡,在云南省汉族中分别发现7、7、8和8个等位基因,在成都汉族中分别发现8、7、8和7个等位基因.四个STR基因座的等位基因频率的分布在两个群体之间差异无统计学意义.结论五个基因座的累计识别能力和非父排除率较高,用自制的STR分型标准物,银染法检测这五个基因座的复合扩增在法科学领域中有较高的实用价值.
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复合PCR系统检测间日疟原虫的应用研究
目的:应用一种简易、快速的复合PCR扩增系统检测间日疟原虫(P.v)及混合感染.方法:以间日疟原虫和恶性疟原虫(P.f)小亚单位核糖体核糖核酸基因(SSUrDNA)特定片段为靶基因,设计并合成引物,建立复合PCR扩增系统.采用煮沸法快速制备DNA模板研究该系统的敏感性和特异性,并用于临床血样的检测.结果:从间日疟原虫和恶性疟原虫感染血样中分别扩增出分子量大小为705 bp和575 bp的特定扩增带.而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及正常人血样均无扩增带出现.单独检测P.v敏感度达到0.15×10-5(约7个原虫/μl全血),在P.f存在的情况下检测P.v敏感度为0.15×10-4.检测132例疟区门诊病人冻存血标本,104份与镜检法结果相同.并发现14份混合感染和5份为镜检虫种鉴别失误.结论:该系统敏感性高,特异性强,操作简单,并可在一次扩增中同时检出间日疟原虫和恶性疟原虫,具有一定的推广应用价值.
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霍乱弧菌检测及快速分型方法的建立
应用PCR结合变性高校液相色谱技术建立食品中霍乱弧菌检测及快速分型的新方法.根据霍乱弧菌外膜蛋白基因序列的特点、O群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌特异性基因序列设计特异性引物,进行单重PCR和复合PCR扩增,产物经DHPLC技术进行检测和快速分型.该PCR-DHPLC检测方法可以用于快速、准确地鉴定细菌培养物是否为霍乱弧菌以及具体的菌群菌,这是霍乱弧茵分型检测的新技术和新方法.
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24个基因座复合扩增系统的应用
目的 建立24个基因座的复合扩增系统,并对其性能指标进行评价.方法 选择24个基因座(包含D8S1179、D5S818、D2S1338、D18S51、D6S1043、D2S441、D3S1358、vWA、D19S433、D16S539、CSF1PO、Penta D、D22S1045、D13S317、D1S1656、D7S820、TPOX、Penta E、D10S1248、TH01、D12S391、D21S11、FGA等23个STR基因座及1个Amelogenin基因座);合成引物,上游端标记荧光染料;收集DNA数据库建库血痕及口腔拭子样本及相关11种动物样本,采用本文方法进行复合扩增;并对方法的准确性、灵敏度、稳定性、种属特异性、检材适用性、混合样本的检验等系统性能指标进行验证.结果 本文复合扩增系统对长保存9年的各种血痕检材完整分型成功率为100％,且均衡性良好,无非特异性扩增,口腔拭子的成功率为97.8％,灵敏度达125pg,对含有抑制剂样本,在血红素浓度≤600μmol/L,腐殖酸浓度≤50ng/μL时检出效果稳定,种属特异性好.结论 本文24个基因座复合扩增系统在DNA数据库建设中具有较好的应用价值.
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复合扩增20个Y-STR基因座及其法医学的应用
目的 建立20个Y-STR基因座的复合扩增体系,进行遗传多态性调查,并评价其法医学应用价值.方法 采用五色荧光素标记技术,对20个Y-STR基因座(DYS391、DYS389I、DYS390、DYS389Ⅱ、DYS438、DYS460、Y GATA H4、DYS456、DYS439、DYS635、DYS448、DYS393、DYS388、DYS437、DYS19、DYS392、DYS458、DYS447、DYS385 a/b)进行复合扩增和毛细管电泳检测；调查辽宁汉族376名无关男性个体20个Y-STR基因座的遗传多态性数据；并对系统性能进行检测.结果 本文方法同时检测20个Y-STR基因座,在376名个体中共检出376种单倍型,基因多样性在0.371 1～0.969 8之间；方法特异性好,分型结果准确稳定,灵敏度达0.062 5ng,实际案例常见生物检材的检验结果良好.结论 20个Y-STR基因座复合扩增检测法可以用于实际案例检验,调查所获数据对建立Y-STR数据库和相关研究和应用具有重要意义.
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五色荧光标记20个基因座复合扩增体系及法医学应用
目的 建立20个基因座五色荧光标记复合扩增检测体系,并评价其法医学应用价值.方法 收集368份无关人血样及55份实际案例样本(包括血斑、体液斑、组织及毛发),采用五色荧光素标记技术,对Amelogenin和19个STR基因座(D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、Penta E、TH01、D12S391、D2S1338和FGA)进行基因型检测,并考察方法的一致性、灵敏度、种属特异性及检材适用性.结果 本文五色荧光标记复合扩增检测体系可对所选20个基因座分型,结果稳定准确,且均衡性良好、无杂峰；群体调查显示累积个人识别率和累积非父排除率分别是0.999999999999999999999和0.99999999；灵敏度达125pg,种属特异性高,实际案例检材分型成功率高.结论 本文五色荧光标记复合扩增检测体系各项指标可达到当前商品化试剂盒的检测水平,具有重要的法医学应用价值.
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中国"罪犯DNA数据库"STR基因座研究
选择合适的STR基因座,建立中国"罪犯DNA数据库"模式库.以2211名汉族、150名维吾尔族、104名回族群体为分析对象,提取罪犯血样DNA,用复合PCR和四色荧光技术检测了D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D16S539、TH01、TPOX、CSF1PO、D7S820等13个STR基因座及性别Amelogenin 基因座.在13个STR基因座中,除TH01、TPOX基因座外,其余各基因座的个体鉴别能力(DP)值均接近0.9,杂合度(H)均大于0.7,排除概率(PE)大都在0.5以上,其中FGA、D8S1179、D21S11和D18S51基因座DP≥O.95,H≥0.85,PE≥0.65,表明它们在法医学上极有应用价值.TH01和TPOX在多态性方面较差(H分别为0.6430和0.6296,PE分别为0.4046和0.3701),但也符合应用于法医学的要求.13个基因座的平均偶合率为5×10(-15)～1.2×10(-14),适合作为中国人群的遗传学标志,用于建立中国"罪犯DNA数据库".
