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石蜡包埋组织中3种DNA提取方法的比较及优化
近年来,分子病理学技术迅速从科研发展到常规的病理诊断.目前常规检测包括:细菌病毒的检测[1-3]、肿瘤相关基因的突变[4,5]、靶向药物的分子检测[6,7]等,存档的福尔马林固定-石蜡包埋组织(formalin fixed and paraffin embedded tissues,FFPET)常常是形态学研究的宝贵资源,回顾性基因的研究与患者的治疗和临床诊断密切相关.因此DNA提取的质量将直接影响所有以DNA为研究对象的分子生物学实验,对复杂的多重PCR如T/B细胞克隆评价[8]、应用Array-CGH[9]、MLAP-based测定[10]等DNA的质量和纯度提出更高的要求.但是从FFPET中提取DNA以及用DNA进行基因研究中存在检测成功率低、重复性差等问题,多数文献描述提取DNA方法成功率为60%～80%[11],因此提取DNA的质量、纯度、片段的长度决定后续实验的成功与否.同时,对石蜡组织提取DNA前样本的量在很多文献中描述不一,针对提取DNA的方法不同,选择合适的组织样本量,本组研究通过比较不同抽提方法对肿瘤组织不同蜡膜用量所得DNA质量,总结3种提取DNA的方法对应合适的蜡膜用量,建立标准化操作程序.
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石蜡包埋组织基因组DNA提取的条件优化
DNA提取是分子生物学研究的基础工作.在进行回顾性实验研究时,病理科保存的大量石蜡包埋组织(paraffin-embedded tissues, PETs)系分子生物学研究材料的可靠来源,但从福尔马林固定的PETs中提取高质量的DNA仍存在一定难度.PETs在制作过程中受到多种理化因素影响,造成DNA降解严重,使得PCR扩增结果不稳定.如何避免DNA分子损失,保持DNA相对完整和纯度是亟待解决的难题.本研究通过比较不同脱蜡方法和抽提方法所得DNA的质量,旨在找到一种安全有效的PETs中提取DNA的方法.
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石蜡包埋组织PCR检测中DNA提取方法的比较及改进
目前,PCR常用于新鲜组织或细胞提取标本中的核酸分子的检测,较少用于检测石蜡包埋的陈旧组织中的DNA,其主要原因是后者核酸的提取较为困难.针对这种情况,我们在对文献报道的几种石蜡包埋组织提取DNA的方法进行了比较的基础上,进行了改进,提高了石蜡包埋组织提取DNA进行PCR的阳性率,现介绍如下.
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全自动核酸提取仪与手动提取组织DNA的效率比较
近年,随着众多与疾病诊断、预后及治疗相关的分子标志物的出现,以石蜡组织DNA为材料进行分子水平的基因检测及筛查已成为临床诊断及相关研究的常规手段.对于各种基因分析而言,重要的是能够获得足够纯度和数量的DNA[1].DNA提取是分子生物学研究的一项基础技术,其提取的质量好坏及数量的多少直接影响到分子生物学实验的开展[2].目前病理科所使用的DNA大部分为人工提取,使用全自动核酸提取仪提取DNA者占极少数.因此,本实验由两名分子实验室技术员独立完成对全自动核酸提取仪与手动提取核酸进行提取DNA效率的验证比较.
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探讨两种石蜡包埋组织DNA提取方法
随着精准医学和个体化医学的快速发展,人们对分子检测的研究越来越广泛、越来越深入;寻找疾病的遗传学发病因素,对不同患者实施适于其病情的治疗及使用不同剂量的药物逐渐成为医学发展的方向[1,2].新鲜组织、石蜡包埋组织、外周血、胸腹水等样本中核酸的提取,是分子生物学的基本要求.由于患者病程及身体状况等原因,很多情况下短期内获取人体新鲜组织、胸腹水等标本较困难,而甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixed paraffin-embeded tissue,FFPET)可以长期保存,所以可以将这些新鲜组织及胸腹水等样本制作成FFPET备用,从而为分子生物学研究提供宝贵的标本[3,4].
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甲醛固定石蜡包埋胃癌组织中三种DNA提取方法的比较
目前国内大多数医院均用10％中性福尔马林固定手术标本.随着分子生物学技术的不断发展,这些标本是可靠的分子生物学研究材料来源,在医学检验、法医鉴定、大宗病例回顾性研究等方面得到广泛应用.已有研究证明石蜡包埋组织在制作及保存过程中受多种试剂等因素的影响,导致DNA脆性增加、DNA与蛋白质交联等问题,为从中保质保量地提取DNA带来困难[1],其原因可能由于所用标本组织的类型、制作过程、保存条件和时间以及具体实验操作方法的差异所致.文献报道从石蜡包埋组织中提取DNA的方法比较多[2-5].本实验通过改良试剂盒提取法克服了影响提取DNA的因素,简化了实验操作步骤,一定程度地避免了标本量的损失,从石蜡包埋胃癌组织中获得的DNA可有效用于PCR扩增和DNA测序.
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不同组织中DNA提取及其影响因素分析
根据医疗科研的需要,我们分别从人全血、新鲜组织及OCT包埋冰冻组织中提取DNA,提取的方法各有不同,特别是我们自己摸索了一套提取OCT包埋冰冻组织DNA的方法.在实验过程中,分别总结了各方法的影响因素,供实验工作者应用时参考.
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干血滤纸片试剂盒和水煮法提取间日疟原虫DNA用于PCR检测的比较
目的:比较水煮法和干血滤纸片基因组DNA分离试剂盒提取间日疟原虫DNA用于PCR检测及克隆研究的差异.方法:采集间日疟患者末梢血制备干血滤纸片,分别用水煮法和QIAamp DNA mini kit试剂盒提取间日疟原虫基因组DNA 10份.PCR扩增LDH基因,并克隆质粒pGEM-PvLDH.分析比较2种提取方法的差异.结果:水煮法和试剂盒法提取的间日疟原虫gDNA,均扩增出LDH基因特异条带,但试剂盒提取的gDNA目的条带亮于水煮法.结论:水煮法操作简便、快速、经济,在等量血源条件下,所得DNA量较少、纯度较低;试剂盒提取可获得较高的得率,在定量检测和复合扩增时受到的影响因素较少,成功率较高.
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冻存血与新鲜血的DNA抽提效果的比较研究
目的探讨一种简单便捷、可用于PCR扩增的人体外周血标本冷冻保存的方法.方法外周血标本冷藏于普通冰箱冷冻室2～4周,采用常规方法,提取28例新鲜血标本及31例冻存血标本的DNA,经2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶分析软件半定量分析,比较冻存血和新鲜血的DNA抽提效果.采用PCR方法扩增抽提DNA标本的ABCB4基因外显子6,研究冻存血中提取的DNA能否用于PCR实验.结果新鲜血组的光强度值为24948.98±10246.97,冻存血组DNA标本的光强度值为22917.65±11545.63,两组间无显著性差异(P＞0.05).所有冻存血中提取的DNA标本,经PCR扩增均有目标带.结论简易冷冻保存的外周血标本中提取的DNA质量与新鲜血无明显差别.冻存血的DNA标本可以用于PCR实验.
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PCR方法从脑脊液中检测脑膜炎奈瑟菌的实验
[目的]探索快速、可靠的检测脑膜炎奈瑟菌的方法.[方法]以煮沸法裂解细菌获取PCR反应模板,或以基因组DNA纯化试剂盒提取DNA后,用PCR法扩增脑膜炎奈瑟菌crgA基因;对PCR产物进行DNA测序.扩增siaD(C)基因确认C血清群脑膜炎奈瑟菌.[结果]煮沸法和试剂盒提取DNA法均可从1份标本中PCR扩增crgA基因阳性,PCR产物DNA序列与NCBI GenBank crgA基因(登录号AF190471)序列一致.PCR扩增siaD(C)基因确认为C血清群脑膜炎奈瑟菌.[结论]建立的从脑脊液中检测脑膜炎奈瑟菌的PCR方法,可以更快速、可靠地诊断流脑.
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5种方法提取弓形虫速殖子DNA的效果比较
目的 用5种方法提取弓形虫速殖子基因组DNA,比较其效果.方法 分别以试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯仿法和盐析法提取10倍系列稀释的弓形虫速殖子DNA,通过分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和PCR比较其效果.结果 酚-氯仿法提取的DNA纯度高,煮沸法、盐析法、直接裂解法和试剂盒法依次降低;琼脂糖凝胶电泳可检测出由直接裂解法、酚-氯仿法、盐析法提取1×106个速殖子的基因组DNA;试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯仿法、盐析法提取的DNA经PCR扩增可检测少速殖子的数量依次为1×104 ,无目的条带,1×102,1×101,1×103个. 结论酚-氯仿提取的DNA纯度高,用于PCR扩增具有较高的敏感性,但操作相对繁琐;煮沸法操作简单,与除酚-氯仿法外其他3种方法相比具有较高的敏感性.其它3种方法提取的DNA纯度不高,用于PCR扩增的效果不如前面2种.
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4种试剂盒提取病理组织切片中裂头蚴DNA效果的比较
目的 筛选一种快速、简单、高效、价格合理的从病理组织切片中提取猬裂头蚴DNA的试剂盒.方法 用4种不同的试剂盒提取病理组织切片(含虫白片/HE染色片)中裂头蚴DNA,通过比较所提取DNA的浓度、纯度、提取率、提取时间、提取价格及PCR产物的亮度,评价4种市售商品试剂盒提取DNA的效果.结果 4种试剂盒提取裂头蚴有虫组织白片DNA的结果:试剂盒1提取DNA的浓度、纯度及提取率高,提取成本也高且耗时较短;试剂盒2的提取效果与试剂盒1相近,提取成本较低且时间短;试剂盒3的提取效果介于试剂盒2与试剂盒4之间,成本低但时间长达26h;试剂盒4提取效果低,PCR产物条带也暗,提取成本较低但耗时较长.4种试剂盒提取HE染色片DNA的结果:试剂盒1与试剂盒2提取的效果相近,两者成本较高耗时较短,试剂盒3与试剂盒4的提取效果相近,两者成本低耗时长,试剂盒3与试剂盒4的提取效果均低于试剂盒1和试剂盒2的提取效果.结论 4种商品试剂盒均能满足裂头蚴感染有虫组织的DNA提取,其中试剂盒2更适用于快速提取.
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病理石蜡标本基因检测中DNA提取（离心柱型）的几点体会
随着分子生物技术在临床中开展，其所覆盖的检测疾病的范围越来越广，不仅在常规医学检验中，近年来随着临床靶向治疗的普及，病理肿瘤标本的相关基因检测也得到发展。然而，什么样的病理标本适合做基因检测？怎么才能够得到更多更好的DNA呢？是目前我们病理科开展此项目所面对的问题。经过我们不断实践，现将几点体会介绍如下。
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蛋白酶K对盐析法提取全血DNA的影响
盐析法是目前血液基因组DNA常用的提取方法之一,具有简便、快速、得到DNA的质量高的特点[1].但有的研究中使用了蛋白酶K[2,3],有的研究中未使用蛋白酶K[1,4],均得到了高质量的DNA.为了了解蛋白酶K在盐析法提取全血DNA中的作用,我们以兔血为例进行了研究.
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植物基因组DNA提取方法学评析与验证
分子生物学实验多以提取研究对象的基因组DNA作为研究的起点,由于材料的来源、部位、形态等外在性质的不同,以及化学成分、组织结构等内在特点的差异,常会需要在提取基因组DNA时选择不同的方法,或作一些特殊的处理,如有的植物组织含有较多的多糖及酚、酯、萜等次生代谢产物,从而会影响到所提DNA的纯度及随后的实验分析.因而选择一种简单、快速而高效提取基因组DNA的方法常常成为实验中关键的一步.近几年来已有不少关于通用提取方法的报道,另外一些专属性的方法也有了较大进展.本文拟对这些方法加以总结、比较,以期对它们各自的特点作一剖析,并加以实验改进验证,以期能够在今后的实验中更好地应用.
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白木通基因组DNA提取方法研究
以白木通新鲜叶片为材料,采用改良CTAB法提取DNA,并对提取的DNA进行了纯度鉴定和PCR检测.结果表明:改良的CTAB提取法,能够有效去除次生物质对DNA的干扰,提高提取DNA的质量和纯度,适宜白木通叶片DNA的提取.该改良法提取的DNA可用于SRAP分析.
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深加工阿胶制品DNA提取方法对比探究
目的 针对深加工阿胶制品,选择一种优DNA提取方法,为动物源性真伪鉴定奠定基础.方法 对5种不同的DNA提取方法进行综合比较,获取一种适合阿胶的高质量DNA提取方法.结果 超高速离心法提取的DNA纯度高,质量好,完全能满足下游实验要求.结论 超高速离心法适合深加工阿胶制品DNA提取分离.
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一种从阿胶及制品中提取DNA的新方法
目的：建立一种从阿胶及制品中提取微量DNA的方法，为从分子水平鉴别阿胶中动物源性奠定基础。方法选取市场常见的阿胶补血口服液、复方阿胶浆、阿胶膏和即食阿胶块等4种不同的阿胶制品，使用SDS-蛋白酶K结合Chelex-100法提取DNA，利用玻璃奶纯化DNA。结果此法可从不同阿胶产品中提取微量DNA，其中阿胶膏中获得DNA浓度高，即食阿胶块次之，复方阿胶浆和阿胶补血口服液中少。PCR扩增获得片段利用琼脂糖凝胶电泳和DNA测序验证与目的片段一致。结论建立了从阿胶及其制品中提取高质量DNA的新方法。
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探讨从人血凝块中提取基因组DNA
目的 从人血凝块中提取基因组DNA.方法 室温自然解冻,人工磨碎,用Relax Gene Blood DNA System血液基因组DNA提取试荆盒提取DNA.结果 用此试剂盒从人血凝块中成功提取基因组DNA,提取DNA浓度为16.1±4.7mg/L.结论 用此试剂盒提取的基因组DNA的总量较高,提取效率高,PCR扩增效果好,可很好的用于血凝块基因组DNA的提取.
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不同方法检测水中麻风杆菌的比较
目的:比较不同方法检测水中麻风杆菌DNA分子的敏感性和特异性.方法:采用不同方法提取不同水样中的DNA,用巢式PCR扩增麻风杆菌特异性重复序列.结果:对浑浊水样,DNA Stool Kit提取DNA的效果优于粗提法；对于澄清水,DNA Mini Kit提取DNA的效果与粗提法相同.提高退火温度、减少循环数,PCR检出水平不变,非特异性扩增减少.结论:对不同外观的水样,采用不同方法提取DNA与优化PCR反应条件以减少非特异性扩增很有必要.
