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副溶血弧菌的gyrB基因环介导的恒温扩增技术检测方法的研究
目的 建立一种适合基层实验室应用和开展的快速检测副溶血弧菌的DNA环介导的恒温扩增法(LAMP).方法 针对副溶血弧菌的gyrB基因序列设计了4条引物(2条内引物、2条外引物),并对扩增反应条件进行了优化.结果 整个检测过程仪需1.5 h,可通过肉眼目测或电泳检测判断结果 ;对3株种系背景明确的副溶血弧菌不同实验对照株、23株副溶血弧菌地方分离株和32株其他肠道菌进行了检测,具有很高的特异性;该方法 的低检测限为24 cfu/ml,具有良好的敏感性;应用于61份贝类海产品的现场检测,阳性率为100%,与实时荧光定量PCR方法 的检测结果 相符,阳性率高于传统的培养鉴定方法 .结论 本方法 具有快速、灵敏、特异、简便、经济等特点,适合基层实验室、应急检测或现场监测等使用,具有较高的推广价值.
关键词： 副溶血弧菌 DNA环介导的恒温扩增法 gyrB基因 目测 -
GyrB基因在诺卡菌菌种鉴定中的应用研究
目的 分析研究gyrB基因对于诺卡菌种水平的鉴定能力.方法 采用特异性引物对14种41株诺卡菌的gyrB基因进行扩增,并对其产物进行测序.从GenBank数据库中下载21株诺卡菌gyrB基因序列,对序列用DNAStar软件计算其相似性.利用Mega 6.06软件,采用邻接法和大似然法构建诺卡菌菌种系统发育进化树.结果 以gyrB基因构建的系统发育进化树中,不同诺卡菌种能准确地分离成独立的分支,且亲缘关系较近的近缘种也能得到有效分离.诺卡菌种gyrB基因种内相似性为94.2％ ～ 100％,种间相似性约为79.2％ ～ 97.6％,平均相似性为86.9％.结论 gyrB基因序列分析是一种快速、准确、特异性较高的鉴定方法,能将诺卡菌属的鉴定至种的水平,对于鉴定诺卡菌属近缘种gyrB基因比16SrDNA更具优越性.
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飞行时间质谱在快速检测地震伤员产气荚膜梭菌感染中的应用
对细菌的正确和快速鉴定可以给患者的诊断和治疗提供有效的帮助.当前细菌的鉴定方法多种多样,有传统的手工经典方法,如API、RapID、微量生化管鉴定,有临床常规使用的全自动或者半自动细菌鉴定仪器,还可以用16 s rDNA和gyrB基因序列分析等分子生物学的方法对细菌进行鉴定[1-2].
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Taqman-探针荧光定量PCR鉴定溶藻弧菌方法的建立
目的 建立一种基于DNA回旋酶B亚单位基因(gyrB)基因的Taqman-探针荧光定量聚合酶链式反应(PCR)鉴定溶藻弧菌的方法.方法 以溶藻弧菌标准株(ATCC)和溶藻弧菌野生株(WT)为研究对象,通过软件设计溶藻弧菌gyrB基因的特异性PCR引物及Taqman-探针,采用荧光定量PCR仪进行检测,评价该检测方法的特异性和灵敏度.结果 Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对溶藻弧菌gyrB基因的检测灵敏度为10-3 mg/L;在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌6种其他常见致病菌时未出现阳性扩增,特异性均为100％.结论 成功建立Taqman-探针荧光定量PCR是一种特异性、灵敏度均较好的鉴定溶藻弧菌的方法,该方法适用于溶藻弧菌的快速检测,具有应用价值.
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建立基于gyrB基因检测结核分枝杆菌复合物的荧光定量PCR法
目的 建立基于gyrB基因扩增检测结核分枝杆菌复合物(MTC)的荧光定量PCR(FQ-PCR)法.方法 根据gyrB基因设计合成引物和探针,建立并评价TaqMan探针FQ-PCR法,并与基于IS6110序列的FQ-PCR法分别检测50例临床标本,比较两种方法的检测结果.结果 建立的FQ-PCR法标准曲线方程为Y=-3.18X+42.84,相关系数(r2)为0.995、扩增效率为106.25％,其检测灵敏度为102 CFU/mL; MTC中结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌阳性,其他分枝杆菌和4株临床其他细菌均为阴性.批内及批间变异系数(CV)均＜2％,重复性良好.本法与基于IS6110序列的FQ-PCR法对50例临床标本的检测结果差异无统计学意义(x2=0.06,P＞0.05),一致性好(κ=0.94).结论 基于gyrB基因扩增的FQ-PCR法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于结核分枝杆菌复合物的早期快速诊断.
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分类及鉴别细菌的新靶标--gyrB基因
gyrB基因普遍存在于各种细菌中,其序列具有保守性和变异性,在以核苷酸序列为基础的细菌分类及鉴别研究中,可作为靶分子.本文就gyrB基因及其在细菌系统发育分析、临床细菌鉴别检测中发挥的作用进行综述.
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应用系统发育分析方法鉴别近缘病原菌
目的:以gyrB基因序列为基础,采用系统发育分析方法构建进化树,对种系关系密切的病原菌进行区分鉴别.方法:测序获得本地区19株大肠埃希菌、13株志贺菌、2株豚鼠气单胞菌、2株嗜水气单胞菌、1株维隆气单胞菌的gyrB基因序列,并将其同公共数据库已有序列合并,构建进化树.分析各序列在树中的聚类关系,以此对菌株进行种水平分类鉴别,并同BLAST查询结果相比较.结果:除鲍氏和痢疾志贺菌外,对检测的所有序列,在进化树上与之邻近的5条序列均为该种菌株.而对一部分菌株,其BLAST查询结果中含有其它菌种的或分类关系不明确的序列.结论:以系统发育方法对种系发生关系密切的病原菌序列进行鉴别,具有较好的分辨力和准确度.
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肠道病原菌gyrB基因系统发育分析
[目的]探讨gyrB基因区分鉴别肠道病原菌的能力，为临床快速鉴定病原菌提供依据。[方法]通过PCR扩增及测序方法，获得肠杆菌科和弧菌科的14种临床常见肠道病原菌gyrB基因序列，合并采集来自GenBank的标准菌株序列，采用距离法构建系统发育树。[结果]在系统发育树的拓扑结构中，除志贺氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌外，同一菌种的不同菌株均聚类形成具有较高的自举支持率单系类群。大肠杆菌演化支内混杂有志贺氏菌分支；嗜水气单胞菌的临床分离株与标准菌株相距较远，未能聚类成单系类群。另外，除乙型副伤寒沙门氏菌外，其余沙门氏菌gyrB序列在血清型水平呈现高度同源性，使得5种血清型各自聚类区分。[结论]采用gyrB基因作为肠道病原菌系统发育分析靶基因是合适的，其可以在菌种水平区分包含肠杆菌与弧菌科的肠道病原菌。
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环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌方法的建立与应用
目的 建立适合基层实验室快速检测副溶血性弧菌的环介导等温扩增(LAMP)方法.方法 根据副溶血性弧菌gyrB基因设计4条特异性引物,并对反应条件进行优化,结果 建立的LAMP体系具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,副溶血性弧菌为阳性,其他菌株均为阴性.该方法对培养的副溶血性弧菌的检测下限为25 cfu/mL,可在60 min内完成扩增反应.用该体系对120份海产品进行检测,阳性率62.5％,与传统方法一致.结论 LAMP法与传统方法相比,可节省大量时间,且对实验仪器要求低,具有良好的实用性.
关键词： 副溶血性弧菌 环介导等温扩增技术(LAMP) gyrB基因 -
宁波地区耐多药结核分枝杆菌喹诺酮耐药gyr基因突变研究
目的 为阐明宁波地区耐多药结核分枝杆菌(Multiple drug-resistant tuberculosis,MDR-TB)的gyr基因突变特征,深入研究MDR-TB对喹诺酮类药物耐药与gyr基因突变特征的关系.方法 采用1％比例法对MDR-TB进行氧氟沙星药敏检测实验,通过DNA直接测序法分析MDR-TB的gyr基因突变情况.结果 120株MDR-TB临床分离株中有34株对喹诺酮耐药,总耐药率为28.33％(34/120).34株耐喹诺酮菌株中,30株gyr基因发生突变,突变率为88.24％(30/34).30株gyr基因发生突变的菌株中gyrA基因突变有29株,占96.67％(29/30),突变位点包括90、91和94位氨基酸;gyrB基因突变有2株,其中1株均合并gyrA基因突变,占6.67％(2/30),突变位点包括499和502位氨基酸.结论 宁波地区MDR-TB对喹诺酮类药物耐药形势较为严峻,gyrA基因突变与MDR-TB对喹诺酮类药物耐药相关.
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耐多药结核分枝杆菌对喹诺酮类药物的耐药性与gyr基因突变的初步研究
目的 分析耐多药结核分枝杆菌(Multiple drug-resistant tuberculosis,MDR-TB)临床分离株的gyr基因突变特点,探讨MDR-TB对喹诺酮类药物耐药产生与gyr基因突变的关系.方法 采用比例法对耐多药结核临床分离菌株进行氧氟沙星的药物敏感性检测,应用DNA直接测序法检测MDR-TB的gyr基因突变情况.结果 125株MDR-TB临床分离株中,50株对喹诺酮类耐药,耐药率为40%.50株耐药菌株中,40株gyr基因发生突变:其中39株gyrA基因突变,突变率为78%,突变位点包括90,91和94位氨基酸;5株gyrB基因突变,其中4株合并gyrA基因突变,gyrB基因突变位点为500,506,534和539位氨基酸.结论 MDR-TB中的喹诺酮类药物耐药态势比较严峻,其对喹诺酮类药物耐药机制主要与gyrA基因突变有关.
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变性高效液相色谱检测食品中蜡样芽孢杆菌
目的:应用PCR结合变性高效液相色谱技术对食品中污染的蜡样芽孢杆菌进行快速准确的检测.方法:利用所报道的蜡样芽孢杆菌gyrB基因引物,PCR扩增,DHPLC检测PCR扩增产物.同时进行方法特异性、灵敏度、精密度试验.结果:DHPLC检测蜡样芽孢杆菌出现特异性样品吸收峰,未检测到蜡样芽孢杆菌的近源种及其他细菌的阳性吸收峰,检测灵敏度可达到10 cfu/ml.结论:本研究所建立的PCR结合变性高效液相色谱检测蜡样芽孢杆菌的方法,特异性好,灵敏度高,快速简便.
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短乳杆菌gyrB基因的扩增与测序
目的:为检测短乳杆菌gyrB基因序列.方法:设计两对简并引物对3种啤酒污染乳酸杆菌进行PCR扩增,获得短乳杆菌部分目的基因片断.并将该片断克隆至pGEM-T Easy载体,经限制性内切酶分析和测序获得短乳杆菌gyrB基因部分序列.结果:通过对序列进行进化树分析,发现该序列与啤酒典型污染菌植物乳酸杆菌gyrB序列相似性较高.结论:短乳杆菌gyrB序列对于建立啤酒中短乳杆菌快速检测具有十分重要的意义.
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郑州地区耐多药结核分枝杆菌gyrA和gyrB基因突变特征及对氟喹诺酮类药物耐药研究
目的 分析郑州地区耐多药(MDR)结核分枝杆菌(MTB)临床分离株中gyrA和gyrB基因突变特征及其对氟喹诺酮类(FQs)药物耐药的特点.方法 收集2015年5月至2016年12月河南省胸科医院收治的256例肺结核患者的痰标本,进行MTB固体罗氏培养、液体分枝杆菌培养,MTB培养阳性者行比例法药物敏感性试验,采用聚合酶链式反应扩增MDR MTB的gyrA和gyrB基因,对扩增产物进行测序和序列比对分析.应用耐药基因判断MDR MTB对FQs药物耐药的敏感性和特异性.结果 256例患者中MTB培养阳性215例,其中非MDR肺结核患者137例,MDR肺结核患者78例.78株MDR MTB临床分离株对氧氟沙星(Ofx)、0.5 mg· L-1莫西沙星(Mfx 0.5)及2.0 mg·L-1莫西沙星(Mfx 2.0)的耐药率分别为55.1％(43/78)、55.1％(43/78)、32.1％(25/78);137株非MDRMTB临床分离株对Ofx、Mfx 0.5及Mfx 2.0的耐药率分别为7.3％(10/137)、5.8％ (8/137)、0.7％(1/137);非MDRMTB临床分离株对Ofx、Mfx0.5、Mfx2.0的耐药率显著低于MDR MTB临床分离株(x2=61.21、66.73、45.87,P＜0.001).gyrA基因、gyrB基因在Ofx耐药株中的突变率分别为90.7％ (39/43)、11.6％ (5/45);gyrA基因、gyrB基因在Mfx 0.5耐药株中的突变率分别为88.4％(38/43)、11.6％(5/43);gyrA基因、gyrB基因在Mfx 2.0耐药株中的突变率分别为100.0％(25/25)、12.0％(3/25).以FQs药物敏感性试验结果为金标准,gyrA基因突变判断MDR MTB对Ofx、Mfx 0.5、Mfx 2.0耐药的敏感性分别为90.7％、88.4％、58.1％,特异性分别为88.6％、85.7％、100.0％,gyrB基因突变判断MDR MTB对Ofx、Mfx 0.5、Mfx 2.0耐药的敏感性分别为62.5％、62.5％、37.5％,特异性分别为45.7％、45.7％、68.6％,检测gyrA基因突变判断MDR MTB对FQs药物耐药的特异性高于gyrB基因突变(x2=17.86、15.44、13.92,P＜0.001),检测gyrA基因突变判断MDR MTB对Ofx耐药的敏感性高于gyrB基因突变(x2 =4.53,P＜0.05).结论 郑州地区MDR MTB对FQs耐药率较高,耐药的主要原因是gyrA基因突变,常见的gyrA基因突变位于94位点.
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副溶血弧菌PCR快速检测
目的 为建立副溶血弧菌的快速、敏感、特异的PCR检测方法. 方法选择gyrB基因作为靶序列设计一对引物,用该引物对副溶血弧菌和10株非副溶血弧菌进行PCR扩增,并且用此方法对30份临床标本进行检测. 结果扩增片断表现出极好的剐溶血弧菌特异性,低检出限为190 cfu/ml. 结论本实验建立的PCR检测方法为一种简便、快速、敏感、特异的副溶血弧菌检测方法.
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广州地区耐喹诺酮结核分枝杆菌gyr基因突变特点
目的 分析广州地区耐喹诺酮结核分枝杆菌临床菌株的gyr基因突变特点,为进一步研究结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物的分子机理提供地区性资料.方法 采用绝对浓度法测定结核分枝杆菌对左氧氟沙星的敏感性,应用DNA直接测序法检测结核分枝杆菌gyr基因的突变情况.结果 23株左氧氟沙星耐药株中,15株存在gyrA基因突变,突变率为65.2%,突变位点包括89位、90位、91位和94位;1株存在gyrB基因突变,突变率为4.3%,突变位点为511位.结论 广州地区耐喹诺酮结核分枝杆菌临床菌株的gyr基因突变情况与其它地区存在差异.
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基于gyrB序列Taqman实时荧光PCR检测在MTC鉴定中的应用
目的：初步分析基于gyrB序列的Taqman实时荧光PCR在MTC（结核分枝杆菌复合群）鉴定中的应用。方法：根据MTC gyrB序列设计引物和探针，应用荧光定量PCR对14株标准株及90株临床分离株进行临床研究，并与测序法结果进行比较。结果：14株标准株中，非洲分枝杆菌与结核分枝杆菌结果为阳性，其余结果为阴性；30株临床分离株与ITS测序比较，有1株NTM结果为阳性，1株MTC结果为阴性，其余菌株检测结果与测序结果符合，分析特异度高；将60株临床分离株的检测结果与测序结果进行比较，得到该方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均为100％。结论：采用基于gyrB序列的Taqman荧光PCR可快速检测和鉴别MTC和NTM。
关键词： 结核分枝杆菌 gyrB基因 Taqman实时荧光PCR
