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禾肾丸对阿霉素肾病大鼠蛋白尿及肾组织nephrin蛋白表达影响
目的:研究禾肾丸对阿霉素肾病大鼠蛋白尿及肾组织足细胞裂孔膜蛋白nephrin表达的影响,为其治疗肾病蛋白尿提供实验依据.方法:SPF级雄性Wistar大鼠随机分为模型组,禾肾丸组(1.8 g·kg-1),贝那普利组(1 mg·kg-1)及空白组.采用一次性尾静脉注射阿霉素6 mg·kg-1复制阿霉素肾病大鼠模型.造模成功后,禾肾丸组及贝那普利组分别给予相应药液,模型组及空白组给予等体积蒸馏水,1次/d,连续28 d.给药结束后,收集24 h尿液,检测尿蛋白,腹主动脉采血,检测血中白蛋白(albumin,Alb),血肌酐(serum creatine,SCr),血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN).苏木素-伊红(HE)检查肾脏组织形态变化,透射电镜观察肾小球足细胞足突及基底膜改变,免疫组化及蛋白免疫印迹(Western blot)法检测肾组织nephrin表达.结果:经禾肾丸治疗后,24 h蛋白尿较模型组显著下降(P＜0.01),血清SCr,BUN显著降低(P＜0.01),Alb显著升高(P＜0.01).组织病理学检查显示,禾肾丸组肾小球上皮细胞肿胀明显减轻,部分肾小球体积略增大,系膜细胞及系膜基质仅见轻微增生,管腔内未见小管有蛋白管型.超微结构研究显示,禾肾丸组肾小球基底膜光滑均匀,略见增厚,足突清晰完整、偶见融合.免疫组化结果显示,禾肾丸组nephrin蛋白阳性面积率显著高于模型组(P＜0.01).Western blot结果显示,nephrin蛋白表达量较模型组显著升高(P＜0.01).结论:禾肾丸可能通过上调nephrin表达水平,修复受损足细胞而减少蛋白尿、保护肾脏.
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健脾祛湿和络方含药血清对足细胞标志蛋白Nephrin、Podocalyxin及mTOR表达的影响
目的 探讨健脾祛湿和络方(Jianpi Qushi Heluo Formula,JQHF)含药血清对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的小鼠足细胞损伤模型标志蛋白Nephrin、Podocalyxin及mTOR相关自噬因子表达的影响.方法 以体外培养小鼠足细胞为研究对象,除空白组外均以PAN(100 μ/mL)体外诱导足细胞,根据含药血清细胞培养基的不同分为空白组(10％空白血清),模型组(10％空白血清+PAN),JQHF低剂量组(10％低剂量JQHF含药血清+PAN),JQHF中剂量组(10％中剂量JQHF含药血清+PAN),JQHF高剂量组(10％高剂量JQHF含药血清+PAN),替米沙坦(TMST)组(10％TMST含药血清+PAN),醋酸泼尼松(PRE)组(10％ PRE含药血清+PAN),雷帕霉素(RAP)组(100 μg/L RAP+10％空白组血清+PAN).CCK-8法检测足细胞损伤模型在各组血清作用后的活性变化;Western blot法检测各组足细胞标志蛋白Nephrin、Podocalyxin及细胞内mTOR相关自噬蛋白表达水平.结果 (1)与空白组比较,模型组细胞活力显著下降(P＜0.01),与模型组比较,JQHF高剂量、TMST、PRE及RAP组足细胞活力上升(P＜0.05);(2)与模型组比较,除JQHF低剂量组Podocalyxin表达外,其余各药物干预组Nephrin、Podoca-lyxin表达均增多(P＜0.05,P＜0.01);与JQHF低剂量组比较,JQHF高剂量、TMST、PRE及RAP组Nephrin表达增多(P＜0.05);与JQHF中剂量组比较,JQHF高剂量、TMST、PRE及RAP组Nephrin表达增多(P＜0.05),TMST、PRE、RAP组Podocalyxin表达亦增多(P＜0.05);与JQHF高剂量组比较,TMST、PRE、RAP组Podocalyxin表达增多(P＜0.05).(3)与模型组比较,各药物干预组LC3-Ⅱ表达均增多(P ＜0.05,P＜0.01),JQHF高剂量组、TMST组、PRE组、RAP组P-mTOR、P-4EBP1表达均减少(P＜0.05),JQHF高剂量组、TMST组、RAP组P-P70S6K表达减少(P＜0.01).结论 JQHF可以改善细胞内自噬水平,修复PAN诱导损伤足细胞,与上调细胞内Nephrin、Podocalyxin及LC3-Ⅱ的表达,减少mTOR及相关因子合成有关.
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大鼠足细胞原代培养及观察
目的 建立一种操作简便、重复性较好的大鼠肾脏足细胞分离和培养方法,并观察体外培养足细胞的生长特性.方法 选用SD大鼠幼鼠,无菌取肾,采用低浓度胰蛋白酶短时间消化结合差异过筛法,获得较高纯度的肾小球,接种于25cm2培养瓶,放置于37℃、5％ CO2的恒温恒湿培养箱培养.采用细胞免疫组化技术,对所提取的细胞进行免疫染色鉴定,并在光学显微镜下对足细胞进行跟踪观察.结果 培养第3天,可见有部分细胞从贴壁的肾小球爬出,第5天可见细胞成铺路石样生长,待第8天细胞汇合度达70％～80％,消化细胞传代培养,采用传代培养7d的细胞进行免疫组化检测,细胞内足细胞标志蛋白Nephrin呈阳性表达,足细胞纯度高达95％以上.足细胞生长良好,继续培养分化形成具有特殊形态的成熟足细胞.结论 本实验成功建立了大鼠足细胞的提取、培养和鉴定方法,操作简单、重复性好、纯度高,为下一步足细胞相关研究奠定了基础.
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贝那普利对早期糖尿病肾脏疾病足细胞损伤保护作用的实验研究
目的 探讨贝那普利对早期糖尿病肾脏疾病(DKD)足细胞损伤保护作用. 方法 选取SPF级雄性Wistar大鼠40只,随机分为正常对照(NC)组、单肾切除(SNE)组、DKD组和贝那普利(Ben)组,每组10只,其中DKD组和Ben组采用60 mg/kg STZ腹腔注射建立DKD模型,成模4周后,Ben组予10 mg/(kg·d)贝那普利灌胃,DKD组、SNE组和NC组4周后予等量蒸馏水灌胃.检测各组生化指标,观察肾脏组织病理改变及足细胞超微结构,免疫荧光检测肾皮质Nephrin和Podocin蛋白表达. 结果 Ben组多饮多尿症状减轻,第4、8、12周体质量均高于DKD组(P＜0.05);DKD组和Ben组血糖高于NC组、SNE组(P＜0.05);DKD组Scr和24 h尿蛋白定量高于NC组、SNE组,血清白蛋白低于NC组、单肾切除组(P＜0.05);Ben组Scr和24 h尿蛋白定量(81.30±20.46) μmol/L、(190.44±5.10)mg/24 h低于DKD组,血清白蛋白(36.47±1.32)g/L高于DKD组(P＜0.05);DKD组肾组织ATⅡ高于NC组(P＜0.05);Ben组ATⅡ(14.60±0.82)pg/ml低于DKD组(P＜0.05);DKD模型组足突宽度、足突融合率和基底膜厚度高于NC组、SNE组(P＜0.05);Ben组足突宽度、足突融合率和基底膜厚度分别为(0.41±0.01)μm、(34.20％±6.81％)和(0.40±0.03)μm,低于DKD组(P＜0.05);Ben组Nephrin和Podocin蛋白表达较DKD组升高. 结论 贝那普利对早期DKD足细胞有保护作用,其机制可能与降低肾组织ATⅡ,上调Nephrin和Podocin蛋白表达有关.
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糖尿病肾病与Nephrin蛋白
糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)代谢异常引发的肾小球硬化症,它是DM全身微血管病的组成.由糖尿病肾病造成的肾功能衰竭比非糖尿病者高17倍,是糖尿病患者的主要死亡原因之一[1].尿白蛋白排泄率是目前早期发现糖尿病肾病公认的金指标.要减少糖尿病肾病患者的尿蛋白,必须针对尿蛋白发生的机制选择相应的治疗方法.近年来研究发现,足细胞(podocyte)超微结构改变及其相关分子表达变化在糖尿病肾病蛋白尿产生及发展过程中起重要作用[2].下面就足细胞其主要分子Nephrin蛋白作一综述.
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雷公藤多苷对糖尿病大鼠肾小球足细胞病变的保护作用
目的 探讨雷公藤多苷(TWP)对糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞病变及肾皮质nephrin蛋白表达的影响,为糖尿病的治疗提供实验依据.方法 建立高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)诱导DN大鼠模型,按随机数字表法分为DN组13只,小剂量TWP组(每天8 mg/kg)13只和大剂量TWP组(每天16 mg/kg)14只,并以正常大鼠为对照组(n=15).干预12周后检测大鼠24 h尿蛋白量、血肌酐值(SCr)、尿素氮(BUN)、血糖(Glu)、肾质量/体质量的变化,并以光学显微镜及电子显微镜观察肾脏组织病理改变;免疫荧光法检测肾皮质nephrin蛋白表达.用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析.结果 与对照组大鼠[(0.06±0.02)mg]比较,DN组大鼠24 h尿蛋白[(1.87±0.12)mg]明显增加,差异有统计学意义(P＜0.01),TWP干预可显著减少糖尿病大鼠尿蛋白排泄,小剂量和大剂量TWP组尿蛋白分别为(0.98±0.21)、(0.33±0.11) mg,与DN组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05),此效应与TWP干预剂量相关,大剂量TWP组尿蛋白较小剂量TWP组下降更明显,差异统计学意义(P＜0.05).病理结果显示,DN组表现为肾小球体积增大,基底膜增厚,系膜基质显著增多,足细胞足突增宽、融合、细胞减少;TWP组大鼠肾小球、小管间质及足细胞病变明显减轻.免疫组化结果显示,DN组大鼠肾脏皮质nephrin蛋白表达[每个肾小球平均(2.35±1.75)个]较对照组大鼠肾脏皮质nephrin蛋白表达[每个肾小球平均(18.24±2.89)个]明显减少,差异有统计学意义(P＜0.01),而TWP组大鼠肾脏皮质nephrin蛋白表达增加,差异有统计学意义(P＜0.01),且小剂量TWP组[每个肾小球平均(11.34±1.56)个]与大剂量TWP组[每个肾小球平均(15.27±2.03)个]的差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TWP干预可缓解DN大鼠足细胞病变,肾皮质nephrin蛋白表达上调可能在该保护机制中发挥作用.
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缬沙坦与贝那普利联合应用对糖尿病肾病大鼠nephrin蛋白表达的影响
目的 观察缬沙坦与贝那普利联合应用对糖尿病肾病大鼠nephrin蛋白表达的影响.方法 将雄性SD大鼠随机分为正常对照组(NC组)和实验组.实验组通过单侧肾切除+腹腔注射链脲佐菌(STZ)建立糖尿病肾病大鼠模型,随机将鼠模分为糖尿病(DN组)、缬沙坦和贝那普利联合干预组(CT组).8周后采用免疫组织化学方法检测各组大鼠肾组织nephrin表达指数及形态学观察,同时电镜观察肾小球足细胞病理情况.结果 与NC组比较,DN组大鼠肾组织nephrin表达明显下调(t=13.40,P<0.01),CT组轻度下调(t=2.53,P<0.05),CT与DN比较差异有统计学意义(t=10.60,P<0.01);NC组与CT组nephrin免疫组化形态及肾小球足细胞病理大致相同,而DN组形态学及肾小球足细胞病理改变明显.结论 缬沙坦与贝那普利联合应用能提高nephrin的表达,促进足细胞损伤修复,延缓糖尿病肾病的进展.
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蛋白尿慢性肾纤维化大鼠肾组织Nephrin蛋白表达动态变化
目的 检测蛋白尿多柔比星肾损伤大鼠足细胞相对数目及Nephrin的表达变化,探讨Nephrin表达变化在蛋白尿发生发展中的意义.方法 36只雄性SD大鼠随机分为对照组(n=16)和模型组(n=20),应用多柔比星(4 mg/kg)尾静脉注射、一周末后重复的方法建立大鼠蛋白尿慢性肾纤维化模型,于第1次注射多柔比星后4、7、10、13周末收集标本,观察大鼠24 h尿蛋白、血生化指标等,光镜、电镜观察肾组织的病理改变,Western blot检测大鼠肾皮质中Nephrin蛋白的表达,免疫组化观察Wilm肿瘤蛋白1(WT1)表达.结果 ①第4周末开始,模型组大鼠蛋白尿显著高于对照组(P<0.01).②肾脏病理在第7周末时出现局灶肾小球硬化,第13周末肾小球呈明显硬化表现,第10周末见足细胞脱离基底膜.③肾皮质WTl蛋白的表达量逐渐减少,但肾脏Nephrin蛋白表达4周末时较对照组增加(P<0.01),7周末后逐渐降低.结论 足细胞相对密度及相对数量的减少可能是蛋白尿发生、发展的重要因素,病程中Nephrin蛋白表达量呈先升后降的变化趋势,疾病早期其表达增加可能是足细胞抵抗损伤的一种代偿反应.
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FK506对早期糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的保护作用
目的 探讨FK506对早期糖尿病肾病大鼠肾小球足细胞损伤的保护作用.方法 将38只正常雄性SD大鼠随机分为正常对照组(N组)8只、糖尿病肾病组(DN组)10只、FK506治疗组(F组)10只、洛汀新治疗组(L组)10只,其中DN组、F组、L组应用链脲佐菌素(STZ)60mg/kg腹腔注射建立糖尿病大鼠模型.F组成模4周后给予FK506lmg/(kg·d)灌胃,L组成模4周后给予洛汀新10mg/(kg·d)灌胃,DN组与N组4周后给予等量蒸馏水灌胃,每4周末监测各组大鼠血糖(BS)、体质量(BW)、24h尿蛋白定量,药物干预8周后测定各组大鼠的血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、肾质量/体质量(KW/BW),在光镜、电镜下观察肾脏病理组织学改变,应用Westem blot印迹检测足细胞特异标记物Nephrin的蛋白表达.结果 ①与N组比较,DN组大鼠BS、SCr、BUN、KW/BW、24h尿蛋白定量均明显上升(P＜0.05)；与DN组比较,F组和L组上述指标除BS外均明显降低(P＜0.05),且F组和L组之间差异无统计学意义(P＞0.05)；②光镜下,肾组织病理学观察N组无明显异常,DN组可见明显的肾小球体积增大,肾小球系膜细胞增生,系膜区增宽,基底膜增厚；F组、L组较DN组病理改变明显减轻(P＜0.05),且F组和L组之间病理改变无显著性差异(P＞0.05)；③电镜下,DN组肾小球基底膜显著增宽,足突排列紊乱,足突增宽、融合,F组、L组较DN组上述病变有所减轻(P＜0.05)；④Western blot结果显示,DN组肾组织Nephrin蛋白表达较N组下降60.1％(P＜0.05),F组和L组可明显恢复肾组织Nephrin蛋白的表达(P＜0.05).结论 FK506可能部分通过恢复糖尿病大鼠肾组织Nephrin蛋白表达、维护足细胞结构和功能的完整而发挥减少尿蛋白、延缓DN进展的作用.
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咪唑立宾对阿霉素肾病大鼠肾小球nephrin和转化生长因子β1蛋白表达的影响
目的 探讨咪唑立宾对阿霉素肾病大鼠肾小球足细胞相关蛋白nephrin和转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)表达的影响.方法 雄性SD大鼠36只,随机分为模型组、干预组和对照组各12只;模型组和干预组大鼠经尾静脉注射阿霉素6.5 mg/kg建立阿霉素肾病大鼠模型,对照组注射等量生理盐水;1周后,干预组给予咪唑立宾20 mg/(kg·d)灌胃,1次/d,连续8周,对照组和模型组给予等量蒸馏水灌胃.8周末,检测3组大鼠24 h尿蛋白定量及血生化指标,取肾脏组织行组织病理学检查,采用免疫组织化学法检测nephrin和TGF-β1蛋白阳性表达率,采用Western blot法检测nephrin和TGF-β1蛋白相对表达量.结果 模型组和干预组大鼠24 h尿蛋白定量[(334.2±79.8)、(150.8±61.2)mg]、三酰甘油[(4.98±2.23)、(1.78±1.04) mmol/L]和总胆固醇[(6.28±2.89)、(4.99±1.98)mmol/L]水平均高于对照组[(19.4±4.2)mg、(0.28±0.12) mmol/L、(1.54±0.53)mmol/L) (P＜0.05),血白蛋白水平[(22.80±1.11)、(26.22±1.68)g/L]低于对照组[(32.50±0.78)g/L](P＜0.05),模型组24 h尿蛋白定量和三酰甘油水平高于干预组(P＜0.05),血白蛋白水平低于干预组(P＜0.05),总胆固醇水平与干预组比较差异无统计学意义(P＞0.05);3组血清肌酐水平比较差异无统计学意义(P＞0.05);模型组肾小球nephrin蛋白阳性表达率和相对表达量(7％、0.11±0.02)低于干预组(24％、0.49±0.06)和对照组(43％、0.79±0.08),干预组低于对照组(P＜0.05);模型组肾脏TGF-β1蛋白阳性表达率和相对表达量(94％、1.03±0.08)高于干预组(78％、0.75±0.07)和对照组(45％、0.36±0.04)(P＜0.05),干预组高于对照组(P＜0.05).结论 咪唑立宾可增加肾小球nephrin表达,从而减轻足细胞损伤,抑制TGF-β1表达,减少阿霉素肾病大鼠尿蛋白的排泄,减轻及延缓肾小球硬化.
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1,25-(OH)2D3对糖尿病大鼠肾脏Nephrin蛋白表达的影响
目的 探讨1,25-(OH)2D3对糖尿病(DM)大鼠肾脏Nephrin蛋白表达的影响.方法 Wistar大鼠分为对照组、DM组、1,25-(OH)2D3组.建立糖尿病大鼠模型,实验12周末观察各组血尿、蛋白尿、肾组织光镜电镜、免疫组织化学,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测其肾皮质Nephrin mRNA及蛋白的表达.结果 与对照组及1,25-(OH)2D3组相比,DM组大鼠尿红细胞及尿蛋白排泄明显增多,肾小球细胞数亦增加(P＜0.01,0.05),Nephrin mRNA及蛋白质表达明显下调(Pa＜0.01).1,25-(OH)2D3组肾小球细胞数、Nephrin mRNA及蛋白质表达与对照组相比无统计学差异(Pa＞0.05).结论 1,25-(OH)2D3可减轻血尿、蛋白尿,上调Nephrin mRNA及蛋白质的表达而有肾保护作用.
关键词： 糖尿病 1 25-(OH)2D3 nephrin蛋白 -
雷公藤多甙对糖尿病大鼠尿蛋白、肾小球硬化及足细胞的影响
目的 观察雷公藤多甙(TWP)对糖尿病大鼠尿蛋白、肾小球硬化及足细胞的影响,探讨TWP对糖尿病大鼠肾脏保护作用的效果及可能的机制.方法 运用链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型,设立TWP组(给予TWP治疗8周)、厄贝沙坦组(给予厄贝沙坦治疗8周)、模型对照组及正常对照组各8只,检测各组的24h尿蛋白定量、Ⅳ型胶原表达水平以及肾组织中Nephrin蛋白与Podocin蛋白表达水平,并进行比较.结果 8周后各药物干预组24 h尿蛋白定量和肾组织中的Ⅳ型胶原表达水平均低于模型组(P均＜0.05),其中TWP组和厄贝沙坦组间的24 h尿蛋白定量比较差异无统计学意义,但TWP组的Ⅳ型胶原表达水平低于厄贝沙坦组(P ＜0.05)；TWP组和厄贝沙坦组Nephrin和Podocin蛋白表达均强于模型对照组,但TWP组和厄贝沙坦组间比较差异无统计学意义.结论 TWP可能通过减少糖尿病大鼠的尿蛋白及减轻其肾小球硬化达到保护肾脏的作用,其机制可能与TWP具有保护肾脏足细胞的功能有关.
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肾脏Nephrin蛋白及临床治疗药物研究进展
肾脏Nephrin蛋白分是组成裂孔膜的主要成分,对于维持裂孔隔膜的结构完整性起关键作用.许多临床肾脏疾病药物都对nephrin蛋白有着明显的影响,通过药物作用下调Nephrin蛋白的表达水平,能起到减轻蛋白尿及保护肾脏功能的作用.现就肾脏Nephrin蛋白及其治疗药物研究进展作一综述.
