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麦冬提取物对胰岛素抵抗大鼠肝组织miRNA-29a及FOXO3表达的影响
目的:探讨麦冬提取物对胰岛素抵抗大鼠肝组织中miRNA-29a及FOXO3表达的影响.方法:选取60只SD级雄性大鼠,随机选取10只为正常组,其余50只建立胰岛素抵抗大鼠模型,造模成功后分为模型组、麦冬提取物高、中、低剂量组、二甲双胍组5组,每组10只,麦冬提取物高、中、低剂量组分别给予150,300,500 mg· kg-麦冬提取物灌胃给药干预,二甲双胍组给予200 mg·kg-1二甲双胍混悬液灌胃给药干预,正常组及模型组给予等体积的生理盐水,分别于给药4,8周后,检测各组大鼠体重(BW),肝重(LW),空腹血糖(FBG),血清总胆固醇(TC),甘油三酯(TG),空腹胰岛素(FINs),胰岛素敏感指数(ISI),肝脏指数(LI),C肽;苏木素-伊红(HE)染色观察肝脏病理变化;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测肝组织miRNA-29a,FOXO3表达水平.结果:正常组大鼠饮食正常,皮毛整洁,精神状态良好,模型组大鼠精神萎靡、皮毛凌乱欠光泽,懒惰,麦冬提取物组及二甲双胍组大鼠皮毛欠光泽,有不同程度活动及饮食减少,精神状态优于模型组;麦冬提取物可明显降低胰岛素抵抗大鼠BW,LW,LI,C肽水平(P＜0.05),明显降低TC,TG,FINs水平(P＜0.05),显著升高ISI水平(P＜0.05),改善大鼠胰岛素抵抗;麦冬提取物明显改善胰岛素抵抗模型大鼠脂肪变性,改善肝脏病理状态;麦冬提取物可明显下调miRNA-29a表达,上调FOXO3表达,且呈现一定剂量依赖性(P＜0.05).结论:麦冬提取物可明显改善胰岛素抵抗,推测其机制为下调miRNA-29a表达,上调FOXO3表达.
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FoxO3腺病毒载体的构建及对脑缺血损伤中自噬相关蛋白的影响
目的：构建转录因子FoxO3的过表达腺病毒载体AV-FoxO3，包装产生高滴度腺病毒；观察其感染氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation, OGD)损伤小鼠海马细胞系HT22细胞自噬相关蛋白表达的影响。方法：在GenBank中查询FoxO3基因及其上下游的序列，设计合成引物并在引物中引入HA序列，逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)体外扩增目的基因，用限制性内切酶NheⅠ-HF和Af1Ⅱ双酶切表达载体pAdeno-EF1-BGH-MCMV-EGFP-3FLAG，使用无缝克隆试剂盒将目的基因构建进表达载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子进行菌落PCR鉴定获得阳性克隆(FoxO3重组质粒)并测序；利用AdMax系统在 HEK293A 细胞中分别包装FoxO3重组质粒与对照质粒，得到AV-FoxO3和CMV-GFP-A.D.并测定病毒滴度；用AV-FoxO3和CMV-GFP-A.D.感染HT22细胞，荧光显微镜观察感染是否成功，Western Blot检测HT22细胞中HA蛋白(重组FoxO3序列中所含的标签蛋白)的表达；Western Blot检测OGD损伤HT22细胞中自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达。结果：菌落PCR和测序结果均表明FoxO3重组质粒构建成功；与辅助质粒共包装感染细胞获得腺病毒颗粒，测定滴度分别为6.32×1010 Ifu/mL和4×1011 Ifu/mL；荧光观察及Western Blot检测均说明AV-FoxO3成功地感染了HT22细胞；FoxO3过表达促进自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达。结论：AV-FoxO3构建成功并可用于HT22细胞的感染，增加细胞内FoxO3表达；FoxO3参与调控自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达。
