首页 > 文献资料
-
猪链球菌2型二肽酶Ⅳ的克隆、表达及酶活性鉴定
目的 克隆表达猪链球菌2型二肽酶Ⅳ(DPPⅣ)编码基因,分析表达产物的免疫原性,并测定其酶活性.方法 采用PCR法,从四川资阳中毒性休克综合征病人分离株05ZYH33基因组扩增DPPⅣ的编码基因dppⅣ,构建重组表达质粒pET32a-dppⅣ,转化E. coli BL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物通过SDS-PAGE鉴定,并用western blot检测其抗原活性;后对表达产物进行亲和层析纯化,测定其在不同pH、温度下的酶活性.结果 dppⅣ基因在原核细胞中得到高效表达,在适温度和pH下具有强酶活性.结论 我国猪链球菌2型毒力株 05ZYH33含有dppⅣ基因,在原核系统高效表达的重组蛋白具有良好的免疫原性和酶活性.
-
猪链球菌致菌血症1例
2000年6月,我们从1例风湿性心脏病患者的血液中3次分离到Streptococcus porcinus( 猪链球菌),报道如下. 1 病例摘要患者,女,47岁,因反复劳累后心悸、气急35年,浮肿6年余入院,入院时寒颤高热 ,T 3 9.2℃,查血象WBC 10×109/L,N 0.88.患者分别3次抽静脉血做细菌培养, 均检出 S. procinus(猪链球菌),经用环丙沙星、氧氟沙星治疗3天,体温恢复正常,血培养转阴患者出院.
-
猪链球菌脑膜炎7例报告
1999年8～9月我院收治化脓性脑膜炎患者7例,其中5例脑脊液中分离到猪链球菌2型,现报告如下.
-
猪链球菌感染防治并不难
四川出现"怪病""真凶"很快查明2005年6月下旬以来,四川省资阳市相继发生了以急性起病、高热、伴有头痛等全身中毒症状,重者出现中毒性休克、脑膜炎为主要临床表现的病例.
-
人猪链球菌感染研究进展
猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是链球菌属一员,是猪群正常的携带菌,有时会导致猪群发病和殃及人类,其所致的疾病属于人畜共患性疾病.至目前全世界报道人的SS病S已200多例;国内也见多地区的人群发生此病.2005年7至8月份,四川资阳地区的民众大规模地爆发此病,病例数达200多例,死亡39例[1,2];随后就有较多的有关此病的报道.作者就有关此病的若干现状扼要地综述如下.
-
一株人血源猪链球菌的分离鉴定与毒力基因检测
目的 对北京某医院就诊的一例疑似人感染猪链球菌病患者的血液来源菌株进行鉴定与毒力因子检测分析.方法 将患者血液分离菌株接种哥伦比亚血琼脂平板,经革兰氏染色镜检、血清凝集试验、VITEK 2 Compact微生物分析仪以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测后,再用PCR技术检测猪链球菌种特异性基因(16SrRNA)和猪链球菌2型特异性荚膜多糖编码基因(cps2J)以及多个毒力基因:溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、溶血素(sly)、细胞外蛋白因子(ef)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、纤粘连蛋白结合蛋白(fbps)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的编码基因和毒力相关基因orf2.结果 传统细菌鉴定方法和蛋白质谱技术以及核酸检测方法将这株患者血源性细菌分离株鉴定为猪链球菌2型,该菌株的毒力基因cps2J、sly、ef、gdh、fbps、gapdh和orf2的PCR检测均为阳性,mrp基因为阴性.结论 该株人血源细菌分离株为猪链球菌2型sly+/ef+/mrp强毒株.
关键词： 猪链球菌 VITEK MALDI-TOF-MS 毒力基因 聚合酶链反应 -
快速检测猪链球菌的环介导等温扩增方法
目的 建立猪链球菌(S.suis)的环介导等温扩增方法(LAMP).方法 通过BLASTn序列比对确定较为保守的S.suis种特异基因,用软件PrimerExplorer V4设计针对靶基因的LAMP试验引物;分别用煮沸法和试剂盒提取法提取基因组做敏感性试验,并用62株非S.suis菌株评价了实验的特异性;再用100株分离自不同地区不同时间的S.suis菌株评价该方法的可靠性.结果 确定了S.suis种特异性基因dnaN为靶基因,并针对该基因建立了检测S.suis的LAMP方法.敏感性实验中,每个反应的检测下限是31.25 fg纯DNA,相当于14个拷贝;煮沸法的检测下限是每个反应27 CFU.在对62株非S.suis菌株与有争议的S.suis菌株的特异性评价实验中,未发现有假阳性.结论 成功建立了针对dnaN基因检测S.suis的LAMP方法.
-
猪链球菌长沙分离株的鉴定与16S rRNA系统进化分析
目的 对2株猪链球菌(Streptococcus suis,SS)长沙分离株进行分离培养和分子鉴定,并对其16S rRNA基因进行测序,阐明其系统进化关系.方法 利用分离培养法对2株 SS进行分离鉴定,同时对分离株16S rRNA 基因进行PCR扩增和核苷酸序列测定,将测序结果提交GenBank,通过在线Blast同源性分析进行菌株鉴定,并与传统培养鉴定方法进行比较,利用Mega4.0软件构建SS长沙分离株系统进化树.结果 成功扩增出2株菌的目的 片段,通过测序后Blast同源性分析,证实2株菌株均为SS,且与传统鉴定方法结果一致,进化树显示长沙2株SS和国内外2型位于同一进化分支上,同四川的05ZYH33参考株亲缘关系近.结论 通过16S rRNA基因可以准确快速鉴定SS,可应用于应急检测,长沙2株猪链球菌属于SS2型,与其他SS2分离株16S rRNA 基因同源性高,未发生变异.
-
猪链球菌真核样丝氨酸/苏氨酸激酶stk基因敲除株的构建
目的 构建猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)2型强毒株05ZYH33真核样丝氨酸/苏氨酸激酶(eukaryoticlike Ser/Thr kinase,eSTK) stk基因敲除突变株.方法 构建中间为壮观霉素抗性基因(Spcr),两侧为stk编码基因上下游同源序列的基因敲除质粒,通过同源重组筛选stk编码基因敲除突变株.结果 组合PCR分析和基因测序结果均显示stk编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代,基因敲除突变株△stk构建成功.逆转录PCR(RT-PCR)证实了stk在转录水平上的缺失.对筛选的突变株进行连续传代培养,证实△stk能够保持稳定的壮观霉素抗性表型.结论 stk基因敲除突变株的成功构建,为阐明该基因在猪链球菌致病过程中的作用奠定基础.
关键词： 猪链球菌 真核样丝氨酸/苏氨酸激酶 基因敲除 突变株 -
猪链球菌细胞壁蛋白SSU05_0272的表达、纯化及生物活性分析
目的 制备获得高纯度的重组SSU05_0272蛋白,并研究其对细胞因子的调控.方法 以05ZYH33基因组为模版,PCR扩增SSU05_0272基因,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达.上清表达蛋白先后经过镍亲和层析和离子交换层析方法 进行纯化.实时定量PCR方法 检测纯化后的SSU05_0272蛋白与人脑微血管内皮细胞作用后其细胞因子的转录水平变化.结果 制备的SSU05_0272蛋白具有较高的纯度,RT-PCR结果 显示,SSU05_0272蛋白与人脑微血管内皮细胞作用后能上调IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β的表达,下调IL-12P40的表达.结论 SSU05_0272蛋白能够调控促炎症细胞因子和趋化因子转录水平变化,提示其在猪链球菌致炎症反应中起重要作用.
关键词： 猪链球菌 SSU05_0272 细胞因子 -
猪链球菌BALB/c小鼠感染模型的初步建立
目的 观察猪链球菌(Streptococcus suis)感染小鼠后的临床、病理变化,为将小鼠作为实验室研究猪链球菌的实验动物提供依据.方法 用猪链球菌活菌经腹腔注射感染小白鼠,并做阴性对照,观察其临床症状,剖解病死小鼠,制作病理切片观察病理变化.并对病死小鼠做病原分离,通过培养特性鉴定、生化试验以及PCR鉴定确定其为猪链球菌.结果 小鼠确由感染猪链球菌而致死,体内各组织、器官均产生典型的败血症病变.结论 小鼠对猪链球菌易感,能够作为实验室研究猪链球菌良好的实验动物.
关键词： 猪链球菌 BALB/c小鼠模型 病理变化 -
猪链球菌2型中国强毒株CovR重组蛋白及其抗体的制备
目的 通过构建pET32a-covR原核表达质粒,表达并提纯CovR重组蛋白,制备其多克隆抗体.方法 采用PCR法,从四川资阳病人分离株05ZYH33基因组扩增CovR的编码基因covR,构建重组表达质粒pET32a-covR,转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE鉴定后,His亲和层析柱纯化CovR重组蛋白;免疫新西兰兔制备特异性抗体,Western blot检测兔多抗血清的特异性,间接ELISA检测其滴度.结果 covR基因在原核细胞中得到高效表达,重组蛋白免疫新西兰兔后血清效价高达1∶204 800,且重组蛋白能够与之发生特异性的反应.结论 成功构建了表达载体pET32a-covR,可在E.coli BL21中高效表达,制备了特异性抗体,为进一步研究CovR的调控机理奠定了基础.
-
猪链球菌WC-SS7株GDH基因的表达及GDH蛋白单克隆抗体的制备
目的 原核表达猪链球菌7型临床分离株WC-SS7的GDH蛋白,制备抗GDH蛋白的单克隆抗体(mAb).方法 将临床分离的猪链球菌7型WC-SS7株的GDH基因克隆入表达载体pET-30a,转入大肠杆菌中,用IPTG诱导表达,用Ni化琼脂糖柱(Pierce)纯化的GDH蛋白免疫BALB/c小鼠,取鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA方法筛选阳性克隆,对抗WC-SS7 GDH蛋白单克隆抗体进行特异性鉴定及亚型鉴定.结果 表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析后,在约为52KD处可见一条明显的诱导表达带,说明GDH蛋白得到了正确的表达;细胞融合后检测为阳性的细胞株经过3次单克隆筛选,终得到了6株能和GDH蛋白反应的能稳定分泌单抗的阳性细胞克隆,这些单抗通过Western 鉴定结果显示其具有良好的特异性,6株单克隆抗体亚型鉴定结果显示其亚型均为IgG1型,且轻链均为κ链.结论 本研究成功表达了WC-SS7的GDH蛋白,并获得了6株能和GDH蛋白反应的、能稳定分泌单抗的阳性细胞克隆,所获得的重组GDH蛋白及特异性单克隆抗体能用于猪链球菌结构和功能的研究,为猪链球菌临床感染血清学诊断方法的建立奠定基础.
-
表观健康猪群携带猪链球菌情况流行病学调查
目的 了解我国不同地区表观健康猪群携带猪链球菌的情况.方法 从我国20个不同地区屠宰场采集248份扁桃体,进行增菌培养后用PCR方法进行猪链球菌种型鉴定并用血清凝集试验复检,后用多位点序列分型 (Multilocus sequence typing, MLST)系统研究各菌株之间的遗传关系.结果 从248份扁桃体中共检出14株猪链球菌(检出率为5.65%),其中3株为猪链球菌2型,2株为猪链球菌7型,1株为猪链球菌9型,8株未定血清型;对6株定型菌株进行毒力因子(mrp、epf、sly、orf2、fbps、gapdh)检测发现5种毒力基因型:A1 Cps2+mrp-epf+sly+orf2+fbps+gapdh+、A2 Cps2+mrp-epf+sly-orf2-fbps+gapdh-、A3 Cps7+ mrp+epf-sly-orf2-fbps-gapdh+、A4 Cps9+mrp-epf-sly-orf2-fbps+gapdh+、A5 Cps7+ mrp-epf-sly-orf2+fbps+gapdh+,A1和A2型的分离株为弱毒株,其他型菌株的毒力无法确定;经MLST分析,3株猪链球菌2型属于ST1,1株猪链球菌7型属于ST29,1株猪链球菌9型(CQ15)属于一个国际上未报道过的新ST型,该型被猪链球菌MLST数据库(http://ssuis.mlst.net)收录并编号为ST128. 结论不同地区表观健康猪群平均带菌率为5.65%,分离到的猪链球菌2型均为弱毒株.
-
gdh基因在猪链球菌中的分布及重组GDH的抗原性研究
目的 了解谷氨酸脱氢酶基因(gdh)在不同血清型猪链球菌(S. Suis)中的分布情况.分析重组谷氨酸脱氢酶(GDH)的抗原性,为其应用于S. Suis感染诊断和疫苗研究提供实验数据.方法 应用PCR方法检测不同血清型S. Suis中的gdh;利用45kD重组GDH制备多克隆抗体,Western blot方法分析S. Suis各血清型菌株与多克隆抗体的反应以及实验感染S. Suis 2型的猪血清与重组GDH的反应情况.结果 在S. Suis 35个血清型标准株中,除了22、26、27、29、32及34型以外,其余包括1、2、1/2、7、9和14型在内的29个血清型、61株国内外S. Suis 2型分离株全部扩增出目的条带.用重组GDH免疫小鼠,在小鼠血清中均检测到抗GDH的抗体;Western blot结果显示,全部被检菌株与抗GDH血清反应均有单一特异性反应条带,6份实验感染猪血清均能与重组GDH产生反应条带.结论 重组GDH具有免疫原性和反应原性,该蛋白有可能作为建立诊断试验的候选抗原,为进一步开展相关的血清学诊断方法和疫苗研究奠定基础.
-
猪链球菌2型和9型菌株的多重PCR检测
目的建立一种快速、特异且敏感的检测方法.方法以猪链球菌2型和9型的荚膜多糖抗原编码基因簇中的cps2J和cps9H基因、猪链球菌2型的主要毒力因子编码基因epf和mrp为靶基因设计了四对引物,建立了检测猪链球菌的多重PCR反应体系.用编码cps2J和cps9H基因的引物可对猪链球菌2型和9型进行分型,用编码epf和mrp基因的引物可鉴定猪链球菌2型的主要毒力相关基因.用该多重PCR反应体系对10株猪链球菌分离株进行了鉴定,并以其它几株阴性对照菌株进行对照,检测了该反应体系的特异性.以新鲜培养的猪链球菌2型菌株进行倍比稀释后进行菌落计数,并将之作为模板,对该多重PCR反应体系检测的敏感性进行了鉴定.结果 10株猪链球菌分离株中有5株是9型菌株,另有5株是2型菌株,2型菌株有2种基因型:3株cps2+mrp+epf+型,2株cps2+mrp-epf-型.同时还表明该多重PCR反应体系有高度的特异性和敏感性,当模板含量在10cfu时仍能检出目的菌株.结论该多重PCR反体系是一种检测和鉴定猪链球菌2型的快速、特异且敏感的方法.
-
长春地区猪链球菌对大环内酯和林克酰胺类耐药的分子机制研究
目的分析长春地区猪链球菌耐大环内酯类和林克酰胺类的分子机制.方法采用微量稀释法和双纸片扩散法分别测定相关抗生素的耐药谱和红霉素耐药型,并以猪链球菌的染色体DNA为模板,PCR扩增ermB基因和mefA/E基因,然后将其克隆到pMD18-T载体中,用双脱氧链末端终止法测定DNA序列后进行序列分析.结果22株猪链球菌的临床分离菌株均扩增出ermB基因,而未扩增出mefA/E基因;对四环素、环丙沙星和大环内酯和克林霉素有高的耐药率和耐药水平;红霉素的耐药型以CR型为主.同源性分析显示,ermB基因的差异为36%～100%,与GenBank中的肺炎链球菌、粪肠球菌等的erm基因有98%～100%的同源性.结论长春地区猪链球菌对MLSB的耐药是红霉素甲基化转移酶所介导的,以CR型为主的耐药,编码该类耐药的是ermB基因,并与人源及动物源性的耐药基因可能存在着广泛的交换.
-
猪链球菌2型转录调控因子Rex原核表达及体外结合活性分析
目的 克隆猪链球菌2型转录调控因子Rex的编码基因进行原核表达和纯化,对其进行生物信息学分析和体外结合活性测定.方法 PCR扩增猪链球菌2型强毒株SS2-1的Rex基因编码区,将其克隆入pET28a质粒中,再将pET28a-Rex重组质粒转入大肠杆菌表达菌BL21 (DE3)中,重组菌株经IPTG诱导后能表达出猪链球菌Rex蛋白;通过体外凝胶迁移实验(EMSA)对Rex蛋白与DNA的结合活性进行分析.结果 成功地原核表达并纯化了Rex重组蛋白.Rex蛋白与自身启动子Prex特异性结合,高浓度的NADH抑制两者的结合活性,而NAD+对结合没有影响.结论 通过体外结合试验发现Rex是通过响应NADH/NAD+平衡来调控自身基因的表达.
-
2型猪链球菌Rgg调控因子的序列结构分析及原核表达
目的 克隆2型猪链球菌Rgg转录调控因子编码基因并进行原核表达和纯化,并对其进行生物信息学分析和结构预测.方法 PCR扩增2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组的rgg基因,构建重组表达质粒pQE30 rgg,转化大肠杆菌M15,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;确定佳诱导条件后,大量培养诱导重组表达菌,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,非变性PAGE电泳分析其体外聚合状态.结果 整个Rgg蛋白由15个α螺旋和2个β转角组成;构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,15℃过夜诱导获得可溶性重组蛋白的比例高;获得了较高纯度的Rgg重组蛋白,并证实其在体外可形成同源二聚体.结论 成功地原核表达并纯化了Rgg重组蛋白,证明它存在二聚体结构,为进一步研究其调控机制奠定了基础.
-
鉴定7种新型猪链球菌荚膜多糖基因型多重PCR方法的建立
目的 建立针对发现的7种新型别荚膜多糖基因簇(cps)的多重PCR(multiplex PCR)鉴定方法.方法 选择wzy作为靶基因,先以单重PCR筛选每对引物的扩增效率与特异性,再将筛选出的各对引物组建多重PCR,验证其特异性及敏感性后,用其检测91株血清学不可分型的猪链球菌分离株.结果 所建立的多重PCR体系的敏感性为每个反应低可检测到100 pg DNA.在检测的91株菌中,71株可用本研究建立的多重PCR法鉴定,属于新的cps型别.结论 成功建立了特异的可鉴定7种新发现cps型别的多重PCR方法,并且成功应用此法鉴定了大部分血清学不可分型的猪链球菌分离菌株.
