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布鲁氏菌的Rep-PCR分型研究
目的探索对布鲁氏菌属的分子生物学分类方法.方法应用Rep-PCR进行分型研究,以布鲁氏菌属各种型代表菌株为参考,将该方法对国内分离的典型、非典型布鲁氏菌菌株、疫苗菌株进行分类研究.结果使用Rep-PCR方法,不仅在属的水平上可以检测、鉴定布鲁氏菌属,而且能够将107株国内外布鲁氏菌的参考菌株和地方流行菌株分为8个组.结论使用Rep-PCR方法可以对布鲁氏菌株进行分型,将典型和非典型布鲁氏菌进行鉴定和分型,弥补传统分类方法的不足.
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沙门菌REP-PCR分子分型技术的优化及其在耐药菌株中的应用
目的 优化沙门菌REP-PCR分子分型技术,并在沙门菌耐药菌株分型研究中应用,为构建沙门菌同源性追踪体系提供数据.方法 以肠炎沙门菌510041基因组DNA为模板,根据参考文献确定REP引物,PCR扩增其基因组中靶序列.对反应体系模板量、Mg~(2+)浓度和引物浓度的优化,采用对优化项目设置梯度,其它条件不变的方法进行.以优化的REP-PCR法分析24株沙门菌流行耐药株REP-PCR指纹图谱.根据指纹图谱条带对菌株进行分型,并将分型结果与菌株耐药谱分型结果作比较.结果 PCR反应体系DNA模板量100ng/25μl,Mg~(2+)浓度2.0mmol/L,上下游引物浓度各0.4μmol/L时,指纹图谱条带清晰、明亮;不同血清群和血清型沙门菌株间REP-PCR指纹图谱差异较大,可在0.5kb到2.5kh范围内出现2至6条条带;24株沙门菌流行耐药株用该法可分为15型,根据耐药谱可分为7型.结论 建立了优化的沙门菌REP-PCR分子分型技术:REP-PCR指纹图谱分型比耐药谱分型更加敏感.
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REP-PCR对医护人员鼻腔中鲍曼不动杆菌分离株的溯源分析
目的 对医护人员鼻腔中的鲍曼不动杆菌进行分离鉴定,对其来源和传播途径进行分析. 方法 用棉拭子采集10名医护人员和10名非医护人员(大学生)鼻腔样品,分离鉴定非重复鲍曼不动杆菌,采用K-B法检测其对13种常用抗生素的敏感性;利用多重PCR扩增OXA型碳青霉烯酶耐药基因;应用基因外重复回文序列REP-PCR对分离株进行分子多样性分析. 结果 共分离19株鲍曼不动杆菌,其中分离自医护人员鼻腔12株,分离自非医护人员鼻腔7株.K-B法检测Ab的耐药性,医护人员鼻腔分离株对环丙沙星(CIP)、亚胺硫霉素(IPM)、头孢曲松(CRO)、环磷酰胺(CTX)和新诺明(SXT)耐药率均≥41.7％,非医护人员分离株耐药率均≤3％;耐药基因检测19株菌中都携带OXA-51基因,且医护人员鼻腔分离株携带OXA-23菌株数多于非医护人员鼻腔分离株.另外两种未检出耐药基因(OXA-24和OXA-58).REP-PCR显示,医护人员鼻腔分离株、非医护人员鼻腔分离株Ab的8种基因型(A-H)中同源性≥90％的有33株菌,占94.29％(33/35). 结论 鲍曼不动杆菌不仅能通过直接接触传播,也可能存在气源性传播途径.
关键词： 鲍曼不动杆菌 医护人员 OXA碳青霉烯酶耐药基因 Rep-PCR -
金黄色葡萄球菌REP-PCR指纹图谱分型方法优化
目的 优化金黄色葡萄球菌细菌基因组重复序列PCR(REP-PCR)指纹图谱分型方法,并在临床分离株分型研究中应用,为构建金黄色葡萄球菌同源性追踪体系提供依据.方法 试剂盒法提取金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923基因组DNA作为模板,根据参考文献设计REP引物,PCR扩增其基因组中靶序列.优化反应体系Mg~(2+)浓度、模板量、引物浓度和退火温度,以得到佳指纹图谱.以优化好的REP-PCR方法对10株金黄色葡萄球菌临床分离株进行分型.结果 PCR反应体系Mg~(2+)浓度2.5 mmol/L,DNA模板量125 ng/25 μL,引物REP1R、REP2浓度各0.6 μmol/L,退火温度40℃时,指纹图谱条带清晰、明亮;10株临床分离株指纹图谱均在0.5～1.0 kb之间出现1条相同条带,其中1～3,4,5,8,9号菌株图谱相同;7和10号菌株除在0.5～1.0 kb出现1条条带外,还在1.0～1.5 kb出现1条条带,在1.5～2.0 kb出现1条条带;6号菌株共产生5条条带,分别出现在0.5～1.0 kb(2条),1.0～1.5 kb(2条)和1.5～2.0 kb(1条).结论 成功建立优化的金黄色葡萄球菌REP-PCR指纹图谱分型方法;10株临床分离株用该法分为3型.
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沈阳市副溶血弧菌重复序列PCR分型
目的 探讨重复序列PCR对临床分离株副溶血弧菌进行分型的可行性;从分子水平了解沈阳市流行的副溶血弧菌菌型特征.方法 利用基因外重复回文序列-PCR(PEP-PCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)对40株临床分离副溶血弧菌基因组DNA进行扩增,对扩增的DNA电泳指纹图谱进行分型分析.结果 40株副溶血弧菌呈现不同程度的基因多态性.基因外重复回文序列-PCR分辨力指数可达到0.953,40株菌株分为16个型,优势菌型为G型,占总菌数的20.0%.肠细菌基因间共有重复序列-PCR分辨力指数为0.5;40株菌株可分为4个型,优势菌型为D型,占总菌数的67.5%.结论 重复序列PCR可以用于副溶血弧菌临床分离株的分子分型研究,其分型敏感程度优于血型分型.
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基于16S rRNA基因和细菌基因组间重复序列的DNA指纹图谱技术对肝硬化大鼠肝移植后肠道菌群多样性的研究
目的 应用PCR-DGGE和rep-PCR技术对肝硬化大鼠肝移植后肠道菌群多样性进行研究,探讨肠道菌群多样性的变化,并比较这两种方法在菌群分析中的作用.方法 首先建立CCL4诱导肝硬化大鼠的肝移植模型,收取对照组、肝硬化成模时、肝移植后7 d和肝移植后30 d的大鼠粪便,提取细菌基因组DNA,采用PCR-DGGE和rep-PCR[BOX-PCR,ERIC-PCR,ERIC2-PCR,(GTG)5-PCR,REP-PCR]进行DNA指纹图谱分析.结果 PCR-DGGE可明确将正常大鼠、肝硬化大鼠、肝移植大鼠分为3个簇,并显示出肝硬化、肝移植大鼠肠道菌群多样性明显增多.rep-PCR技术也可将各组分开,其中ERIC-PCR、ERIC2-PCR及REP-PCR三者扩增条带各组差异有显著性,鉴别效果更好.结论 应用基于16S rRNA基因和细菌基因组间重复序列的指纹图谱技术对肝硬化大鼠肝移植后肠道微生态的研究具有重要价值,可对临床肝硬化、肝移植患者肠道微生态制剂的使用起到指导作用.
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重复序列PCR与多位点分型技术在热带假丝酵母菌基因分型中的比较
目的 分析比较重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)与多位点分型技术(MLST)在热带假丝酵母菌基因分型中的应用.方法 收集来自5个地区6家医院的147株热带假丝酵母菌,分别以Ca-21、Ca-22、Com-21两两组合为引物,选用合适的引物对进行 REP-PCR后通过电泳获得REP-PCR型.在不同型别中各挑选3株采用MLST法扩增热带假丝酵母菌的6个管家基因,扩增片段测序后与数据库比对得到相应的序列型(sequence type,ST).结果 REP-PCR以Com21-Com21为引物对分型效果好,REP-PCR与MLST分型结果一致.147株热带假丝酵母菌产生A～H共 8种REP-PCR型,分别对应MLST的ST146、新型1、ST136、ST127、ST177、ST169、新型2和ST117.结论 REP-PCR与MLST在热带假丝酵母菌的基因分型中分辨率相同,而REP-PCR更为方便迅速,可作为实验室大量菌株分型的首选方法.
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应用rep-PCR微生物源方法追踪夏秋季桂五水库粪便污染来源
目的:应用重复序列聚合酶链反应(rep-PCR)微生物源追踪方法,追踪夏秋季江苏桂五水库的粪便污染来源追踪.方法:采集已知来源的人和动物粪便标本以及夏秋两季水样标本,分离并确认指示菌大肠杆菌,以BOXA1R为引物进行PCR扩增;用Bionumerics 4.0软件对rep-PCR基因指纹图进行判别分析和多元方差分析并计算各源种类的正确归类率.结果:10、5、3和2分类法平均正确归类率分别为68.13%、74.76%、 82.36%和86.03%.判别分析和多元方差分析结果显示rep-PCR基因指纹图能将已知源不同来源指示菌区分开.水样中主要粪便污染来源为人、鸡和牛.结论:建立的rep-PCR微生物源追踪方法能较好地区分水体中指示菌的不同来源,水体标本监测显示桂五水库粪便污染来源种类多,其中人、鸡和牛相对较多,提示应对桂五水库地区加强人、家禽和家畜动物粪便的无害化管理.
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志贺菌对氟喹诺酮的耐药机制及流行状况研究
目的:研究志贺菌对氟喹诺酮的耐药机制及其流行状况.方法:对氟喹诺酮耐药志贺菌的gyrA基因和parC基因进行扩增、测序,查找突变点;用重复基因外回文序列-聚合酶链式反应(REP-PCR)对志贺菌进行基因分型.结果:两株耐氟喹诺酮的菌株都存在gyrA基因87位Asp(GAC)→Asn(AAC)和177位Gly(GGT)→Ser(AGT)的点突变,一株另有120位Met(ATG)→Leu(CTG)、203位Ile(ATC)→Leu(CTC)、204位Ser(AGC)→Thr(ACC)和205位Ile(ATF)→Leu(CTY)的点突变,另一株还有204位Ser(AGC)→Ile(AAC)的点突变.除87位点突变外,其余突变位点均未见报道.parC基因未发现点突变.REP-PCR基因分型结果提示16株宋内志贺菌有7种指纹图谱,12株福氏志贺菌有两种指纹图谱.结论:两株志贺菌对氟喹诺酮耐药是由gyrA基因点突变所致,耐药表型对突变的类型有一定的预见性,但耐药程度与突变频率的相关性不确定.2004年夏秋季武汉地区散发流行的志贺菌有相同或相似的克隆,血清型单一的宋内志贺菌存在基因多样性,福氏志贺菌中f2a比f4c的遗传多样性高.REP-PCR是一种快捷有效的基因分型法,可用于志贺菌同源性分析及暴发流行时的追根溯源.
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尿路致病性大肠杆菌分离株的耐药性与REP-PCR基因分型
目的:研究尿路致病性大肠杆菌(UPEC)分离株的耐药性和基因分型,为UPEC感染的防治及分子流行病学研究提供实验依据.方法:采用K-B法测定2006-2008年从望京医院病人尿液标本分离的97株UPEC对17种抗生素的敏感性；用基因外重复回文序列PCR(REP-PCR)方法对分离株基因分型.将不同基因型的菌株与它们对17种抗生素的耐药性进行比较,了解分离株的基因型和耐药性的关系.结果:分离株对PIP、LVX和GEN的耐药率高(占65％以上),对IMP和MEM敏感.93.81％的细菌表现为多重耐药.菌株分为了4个耐药组,其中A组和B组耐药性强,D组耐药性弱；REP-PCR方法将97株UPEC分离株被分为4个群,被命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ.各群在A组的耐药率高,而Ⅰ群又在A组中所占比例高.结论:UPEC分离株广泛耐药,各基因型的菌株在耐药性上有一定规律性变化,提示耐药性在菌株之间的传递.亲缘关系近的菌株,表现出相似的耐药谱.应合理使用抗生素,以防止耐药性的产生和快速传递.
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重症监护室环境中分离的鲍曼不动杆菌分析
目的 分析重症监护室物体表面的鲍曼不动杆菌的检出分布、耐药性及其同源性,为医院感染的防控提供依据.方法 从重症监护室不同物体表面采集样品,用全自动细菌分析仪鉴定鲍曼不动杆菌,并对分离株用K-B法进行药物敏感性试验,再用重复序列PCR技术(REP-PCR)检测其基因型.结果 重症监护室不同物体表面共分离鉴定出112株鲍曼不动杆菌,主要分布在空气流通的回风口和患者密切接触的部位.药敏结果显示分离的鲍曼不动杆菌对多种抗生素出现不同程度的耐药,其中哌拉西林耐药率高(58％),米诺环素耐药率低(37％),多重耐药的菌株占41％.REP-PCR检测分为10种基因型,以A型和B型为主,分别占了32％和24％.结论 环境中的鲍曼不动杆菌在重症监护室的物体表面分布较广,耐药菌株较多,应加强监测工作,采取有效的干预措施减少鲍曼不动杆菌引起的医院感染发生.
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rep-PCR基因指纹图微生物源追踪方法建立的研究
[目的]建立重复序列聚合酶链反应(rep-PCR)微生物源追踪方法,应用于淮河流域某水库的粪便污染来源追踪.[方法]采集已知来源的人和动物粪便标本以及水样标本,分离并确认指示菌大肠杆菌,以BOXA1R为引物进行PCR扩增;用Bionumerics 4.0软件对rep-PCR基因指纹图进行判别分析和多元方差分析并计算各源种类的正确归类率.[结果]2分类、4分类和10分类的正确归类率分别为:85.60%、79.20%和70.98%.判别分析和多元方差分析结果显示rep-PCR基因指纹图能将已知源不同来源指示菌区分开.水样中主要粪便污染来源为猪、鸡和人.[结论]建立的rep-PCR微生物源追踪方法能较好地区分水体中指示菌的不同来源,该方法的建立为查找水体中粪便污染来源以及水体治理提供了新技术.
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医院感染鲍曼不动杆菌耐消毒剂基因及同源性分析
目的 分析从我院院感病人分离的多重耐药鲍曼不动杆菌中耐消毒剂基因qacE△1的存在情况及其阳性菌株的同源性.方法 采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析75株多重耐药鲍曼不动杆菌中qacE△1基因,用重复序列PCR技术(REP-PCR)分析阳性菌株的同源性.结果 75株多重耐药鲍曼不动杆菌中,33株qacE△1基因阳性,阳性率44％; 25株泛耐药菌株,13株qacE△1基因阳性,阳性率52％.33株阳性菌株分为5个基因型,其中A型29株,为主要流行型别,B、C、D、E型各1株.结论 我院临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌qacE△1基因携带率较高可能是该菌检出率逐年增多的原因之一,且阳性菌株中存在着以A型为主的感染流行.qacE△1阳性菌株可能易发生多重耐药.
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副溶血性弧菌REP-PCR分型研究
[目的]了解食品中分离的副溶血性弧菌REP-PCR分子型别,探讨DiversiLab系统对副溶血性弧菌的分型能力。[方法]采用以REP-PCR为原理的DiversiLab系统对食品中分离的21株副溶血性弧菌进行分子分型,分析菌株之间的相关性,并与PFGE分型结果比较。[结果]DiversiLab将21株副溶血性弧菌分成16个群,菌株之间的相似度64.5%-99.1%,分离自相同食品中的副溶血性弧菌在REP-PCR聚类图中分在同一个群;7株副溶血性弧菌PFGE分型结果产生7种不同的PFGE型别,菌株之间不相关,在REP-PCR聚类图中分在7个不同的群中。[结论]食品中分离的副溶血性弧菌REP-PCR型别分散,未表现出地区特异性;DiversiLab简便、快速、分辨率高,可应用于副溶血性弧菌的快速分型和溯源。
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沙门菌REP-PCR分子分型技术的优化及其在耐药菌株中的应用
目的:对沙门菌REP-PCR分子分型技术的优化措施进行分析.方法:用试剂盒提取肠炎沙门菌510041(以下简称510041)基因组DNA作为模板,以优化好的REP-PCR方法分析24株沙门菌流行分离株的REP-PCR指纹图谱,根据Versalovic提出的菌株PFGE分型依据对菌株进行分型,并将分型结果与菌株耐药谱分型结果作比较.结果:用试剂盒提取的DNA模板其A1/A2比值均小于1.8,说明提取的DNA模板有残余蛋白质存在.耐药谱分型可将24株沙门菌流行分离株分为7种型别.结论:REP-PCR指纹图谱分型更加敏感,具有显著的科学价值和应用前景.
