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眼镜蛇咬伤的中毒机制与治疗新进展
眼镜蛇,又名饭匙倩、蝙蝠蛇、胀颈蛇、吹风蛇、扁头风.因其遇异常或被激怒时,颈部膨胀出现眼镜一样的花纹而得名.眼镜蛇是我国剧毒蛇中分布广的蛇种之一.夏秋季节眼镜蛇咬伤多见.眼镜蛇毒是以神经毒为主的混合毒素,眼镜蛇咬伤后可引起以神经系统损害为主要表现的多脏器功能衰竭,若不及时抢救,预后极差.
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眼镜蛇镇痛素najanalgesin对大鼠神经病理性疼痛脊髓GLT-1的影响
目的:观察眼镜蛇镇痛素najanalgesin对L5脊神经结扎并剪断(spinal nerve ligation and transection,SNL)大鼠脊髓胶质细胞谷氨酸转运体亚型1(GLT-1)表达的影响,探讨najanalgesin脊髓镇痛机制.方法:100只雄性SD大鼠,随机分为假手术组(A),SNL模型组(B),SNL+najanalgesin组(C),SNL+生理盐水对照组(D),SNL+najanalgesin+脂质体组(E),SNL+najanalgesin+脂质体+GLT-1反义寡核苷酸(As-ODNs,F)6组.鞘内分别注射10μL生理盐水(A,D),40ng·kg-1najanalgesin(C,E,F),每日1次,在注射najanalgesin的同时于第3天一次性注射脂质体+GLT-1As-ODNs10μL(F)以及脂质体10μL(E),术后1,4,7 d(A,B,C,D)及第7天(E,F)取各组大鼠L4～L6脊髓节段,检测各组GLT-1 mRNA和蛋白表达改变.结果:采用SNL成功建立了神经病理性疼痛模型.与假手术组相比,B,D组大鼠GLT-1 mRNA和蛋白表达先增加再降低,C组大鼠GLT-1 mRNA和蛋白表达明显增加,但不随时间变化.与D组相比,C组大鼠第7天GLT-1 mRNA和蛋白表达明显增高.与椎管内注射najanalgesin组相比,椎管内注射GLT-1As-ODNs后,F组GLT-1表达明显下降,而脂质体对照组GLT-1的表达基本不变.结论:najanalgesin可以增加脊髓GLT-1 mRNA和蛋白表达,是其脊髓镇痛机制之一.
关键词： 眼镜蛇毒 神经病理性疼痛 胶质细胞谷氨酸转运体1 脊神经结扎 -
中华眼镜蛇毒诱导人类小涎腺腺样囊性癌细胞凋亡报告
我们尝试应用近年发展起来的对恶性实体肿瘤有较高可评估率的新方法三磷酸腺苷-生物荧光肿瘤化疗药物敏感试验法(ATP-TCA法),测定眼镜蛇毒对人类小涎腺腺样囊性癌(NACC)细胞株的抑制作用,测定眼镜蛇毒与癌细胞存活的量效和时效关系,应用HE染色观察眼镜蛇毒作用NACC细胞后其细胞形态学的改变,以及流式细胞术检测眼镜蛇毒作用后的NACC细胞凋亡等方面的实验,为眼镜蛇毒的抗肿瘤临床应用提供实验依据.
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中华眼镜蛇毒组份J在家兔体内的药代动力学研究
目的探讨眼镜蛇毒(Naja naja atra venom) 组份J兔体内的药代动力学过程. 方法用氯胺-T法对眼镜蛇毒组份J进行125I标记,以放射性核素示踪动力法检测血液中的药物浓度,药-时数据用3P87程序处理. 结果与结论兔静脉注射眼镜蛇毒组份J 3个剂量后,药-时曲线经拟合符合三房室模型特征:快分布相半衰期T1/2α为37.4～41.6min,慢分布相半衰期T1/2β为15.3～16.9hr,消除相半衰期T1/2γ为20.9～21.8hr,三个时相的半衰期各剂量组之间无显著性差异.曲线下面积AUC与剂量成正比,表明药物在兔体内的分布和消除为一级线性动力学过程.
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双价抗蛇毒鸡卵黄抗体制备与生物活性研究
目的 通过双价抗蛇毒鸡卵黄抗体(bivalent anti-snake venom immunoglobulin yolk,双价IgY)的制备及其相关特性研究,为多价抗蛇毒IgY的制备和应用奠定基础.方法 两种单一抗原(舟山眼镜蛇、圆斑蝰泰国亚种)按顺序依次交替注入单只鸡体内,水稀释法制备双价IgY;测定双价IgY效价(间接ELISA法)、交叉免疫特性(双向免疫扩散试验)及对溶膜活性(溶膜试验)、半数致死量(LD50)的中和作用.结果 初次免疫后第28-42天,以水稀释法提取的双价IgY对眼镜蛇毒及蝰蛇毒的效价分别为1:12 800和1:6400.双价IgY与眼镜蛇亚科、蝰业科6种蛇毒有明显的交叉免疫反应,而与蝮亚科4种蛇毒的交叉免疫反应不明显.双价IgY能显著降低眼镜蛇、蝰蛇毒对鸡卵黄膜的溶膜作用,也能显著延长眼镜蛇和蝰蛇伤小鼠的存活时间(P<0.05),同等剂量的双价lgY提高眼镜蛇伤存活率优于蝰蛇伤.结论 双价IgY能够显著中和眼镜蛇、蝰蛇毒的溶膜和致死活性,能有效保护机体免受眼镜蛇毒和蝰蛇毒的攻击.
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高纯度蛇毒因子抗非协调性大鼠异种肝脏移植超急性排斥反应的机制研究
目的探讨高纯度眼镜蛇毒因子(CVF)对非协调性异种大鼠肝脏移植超急性排斥反应(HAR)和存活时间的影响及其机制.方法实验分为CVF治疗组和对照组,每组各20对.在豚鼠到大鼠肝脏移植前24 h实验组大鼠静脉注射CVF(50μg/kg),异种肝脏移植后记录受体生存时间,并观察移植肝的病理变化,免疫荧光法检测肝脏血管C3沉积情况,用大鼠TNF-α ELISA试剂盒检测异种肝脏移植术后1h血清中细胞因子TNF-α水平.结果肝脏移植后,对照组均发生了HAR,肝内小血管血栓形成,间质出血,肝窦和中央静脉可见C3沉积,肠系膜淤血明显. 实验组均无HAR发生,可见延迟性异种排斥反应(DXR)的病理特征,血管内皮细胞(EC)肿胀,单核细胞和中性粒细胞浸润,肝窦和中央静脉无C3沉积,肠道淤血不明显,血清TNF-α水平下调,受体平均存活时间显著延长(1.8±0.6与7.4 ±2.1 h, P<0.01).结论高纯度CVF清除补体可克服非协调性异种肝脏移植的HAR,延长受体存活时间.CVF用于豚鼠到大鼠肝脏移植这一生命支持模型可以更深入地研究非协调性异种肝脏移植的相关机制.
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眼镜蛇毒细胞毒素CTX-d诱导NB4细胞凋亡及其机制研究
目的 探讨眼镜蛇毒细胞毒素CTX-d诱导NB细胞凋亡的机制.方法 MTT法测定CTX-d体外细胞毒作用,电镜、流式细胞仪观察CTX-d对NB4细胞的诱导凋亡作用,流式细胞仪检测NB4细胞线粒体膜电位的变化,Western-blotting测定胞浆细胞色素C及caspase-9、caspase-3的变化.结果 CTX-d作用NB4细胞6、12 h的IC50分别为1.8、1.35 μg/mL;CTX-d引起NB4细胞线粒体肿胀、核固缩等形态学改变;诱导NB4细胞出现亚G1期的凋亡峰,且有时效及量效关系;CTX-d(1.0 μg/mL)作用0.5 h,NB4细胞线粒体膜电位已开始下降,同时在胞浆中检测到细胞色素C,显示细胞色素C已由线粒体释放入胞浆;caspase-9酶原的量在CTX-d(1.0 μg/mL)作用1 h时开始下降,而活化的caspase-3片断在0.5 h即检测到,表明除了通过caspase-9,CTX-d还可能通过其他途径激活caspase-3.结论 CTX-d可通过降低线粒体膜电位、细胞色素C释放,激活caspase-9和caspase-3,从而诱导NB4细胞凋亡,还可能通过其他途径激活caspase-3,参与凋亡作用.
关键词： 眼镜蛇毒 细胞毒素(CTXs) 凋亡 线粒体 -
眼镜蛇毒粗毒毒素Ⅳ对小鼠吗啡行为敏化的影响
目的 探讨眼镜蛇毒毒素Ⅳ对吗啡行为敏化的影响.方法 测定小鼠自主活动,观察毒素Ⅳ对小鼠自主活动影响.昆明种小鼠慢性吗啡处理,建立吗啡诱导行为敏化模型,观察毒素Ⅳ对吗啡行为敏化影响.结果 毒素Ⅳ(0.027、0.04、0.08 mg/kg)腹腔注射后,均能减少小鼠自主活动,降低吗啡诱导的高活动性,抑制小鼠吗啡行为敏化的获得,阻断小鼠吗啡行为敏化表达,其中中、高剂量毒素Ⅳ作用较显著.结论 毒素Ⅳ对中枢神经系统具有抑制作用,可以阻止吗啡成瘾行为形成,对吗啡诱导的敏化行为具有抑制作用,提示毒素Ⅳ对吗啡精神依赖性可能具有干预作用.
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眼镜蛇毒对大鼠丘脑腹内侧核c-jun表达的影响
目的:探讨眼镜蛇毒对大鼠丘脑腹内侧核(VM) c-jun表达的影响.方法:将18只SD大鼠随机分为正常对照组、生理盐水组、眼镜蛇毒组,每组6只.采用免疫组织化学方法观察VM的c-jun表达.结果:与正常对照组和生理盐水组相比,眼镜蛇毒组大鼠VM的c-jun表达增加(P＜0.01).结论:眼镜蛇毒对大鼠VM的c-jun表达有上调作用.
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眼镜蛇毒神经生长因子抑制肝星状细胞增殖并诱导其凋亡
目的:从眼镜蛇毒中分离纯化神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF),观察眼镜NGF对肝星状细胞HSC-T6增殖、调亡活性的影响,进一步为蛇毒NGF在抗肝纤维化治疗提供依据.方法:采用shephadex G-75和CM Sepharose CL-6B二步柱色谱对眼镜蛇毒NGF进行纯化分离;PC12细胞测定各洗脱峰的活性,再用SDS-PAGE鉴定具有NGF活性洗脱峰的纯度和相对分子质量.实验设立空白对照和NGF处理组,分别作用于HSC-T6,培育相应时间,MTT检测眼镜蛇毒NGF对HSC-T6细胞活力影响；HE染色、紫外激光显微镜与透射电镜观察HSC-T6细胞的形态学变化；TUNEL、流式细胞技术检测眼镜蛇毒NGF对HSC-T6细胞凋亡的影响.结果:眼镜蛇毒经PC-12细胞鉴定第Ⅵ峰具有NGF活性；SDS-PAGE检测为电泳纯,相对分子质量为22.3KD;NGF对HSC-T6细胞增殖具有明显抑制作用(2μg/ml NGF的抑制率为49.66％±6.50％,P＜0.05；6.25 μg/ml NGF的抑制率为71.33％±1.53％,P＜0.05)；TUNEL法检测发现NGF干预组的凋亡率28.71％±1.59％(2ug/ml NGF)和34.4％±2.49％(5 μg/mlNGF)明显高于对照组的15.85％±1.58％(P＜0.05);流式细胞仪也有同样的发现,NGF干预组的凋亡率16.12％±3.02％(2 ug/mlNGF)和21.15％±3.31％(5 μg/ml NGF)明显高于对照组的2.7％±1.55％( P＜0.05).结论:眼镜蛇毒NGF能抑制肝星状细胞HSC-T6增殖并诱导其凋亡.
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眼镜蛇镇痛素对大鼠神经病理性疼痛脊髓GLAST mRNA的影响
目的:观察椎管内注射眼镜蛇毒najanalgesin对大鼠L5脊神经结扎并剪断(spinal nerve ligation and transection,SNL)术后脊髓谷氨酸-天冬氨酸转运体GLAST (glutamate-asparate transporter,GLAST) mRNA表达的影响,探讨najanalgesin脊髓镇痛机制.方法:采用L5SNL模拟神经病理性疼痛,von Frey hair测定大鼠术侧后足50％机械刺激撤足反射阈值(50％paw withdrawal threshold,PWT)判断模型成功,real-time PCR检测SNL 7 d后脊髓L4-L6GLAST mRNA表达.结果:SNL诱导大鼠产生了机械痛敏,表现为50％机械刺激PWT降低,模型复制成功.SNL 7d后脊髓GLAST mRNA表达降低,椎管内给予najanalgesin剂量相关上调SNL大鼠脊髓GLAST mRNA的表达.结论:Naj analgesin可以增加脊髓GLAST mRNA的表达,可能是其脊髓镇痛机制之一.
关键词： 眼镜蛇毒 神经病理性疼痛 谷氨酸-天冬氨酸转运体 脊神经结扎 -
眼镜蛇毒的化学成分研究进展
眼镜蛇毒具有广泛的生物学活性.文章综述了近年来眼镜蛇毒中研究较为深入的一些组分的分离提纯、理化性质及其生物活性等方面的研究进展.
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应用仿生亲和层析从广东产舟山眼镜蛇(Naja naja atra)蛇毒中分离纯化镇痛多肽
摘要研究眼镜蛇毒镇痛组分的分离纯化方法,为寻找镇痛效果好,而无成瘾性的新型镇痛药物,在合成出可用于亲和吸附眼镜蛇毒心脏毒素层析介质的基础上,结合阳离子交换UND SphereTM S,凝胶过滤Sehpadex G-50,疏水层析Phenyl SepharoseTM CL-4B,从广东产舟山艮镜蛇毒中分离出镇痛多肽.此外,将凝胶过滤Sehpadex G-50应用于仿生亲和层析之前检测分离效果.得出在一步仿生亲和层析后,用疏水层析的方法分离效果更佳,仿生亲和层析适于第一步分离.
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浙江眼镜蛇(Naja naja atra)蛇毒镇痛多肽的分离纯化及其性质的研究
研究浙江眼镜蛇(Naja naja atra)蛇毒的镇痛活性组分,为寻找镇痛效果好,而无成瘾性的新型镇痛药奠定基础.采用CM-Sephadex离子交换色谱和Sephadex G-50凝胶过滤色谱对浙江产眼镜蛇蛇毒中的镇痛活性组分进行分离纯化.采用PAGE IEF及HPLC等实验方法对产物纯度进行鉴定.采用SDS-PAGE法和HPLC法测定产物的分子质量,用IEF法测定产物的等电点,用小鼠热板法与醋酸扭体法考察产物的镇痛活性.结果表明眼镜蛇毒经3次柱色谱后,产物AAP经鉴定为单一组分.AAP经SDS-PAGE法和HPLC法测定的分子质量分别是7.28Mr和7.25Mr,等电点是9.58.AAP的痛阈提高百分率和扭体抑制率分别为91.3%,77.2%.眼镜蛇毒经3次柱色谱后得到具有镇痛活性的单一组分.
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江西眼镜蛇毒神经毒素的提纯及部分性质鉴定
采用CM-SephadexG50和SP-Sephadex G50两次柱层析,从江西眼镜蛇毒中分离提纯得到电泳纯的神经毒素,它对大鼠膈神经膈肌标本及清醒家兔具有典型的箭毒样作用,小鼠sc的LD50为53μg/kg,等电点为pH8.8,相对分子质量为6 800～7 000,氨基酸组成与台湾眼镜蛇毒神经毒素Cobrotoxin非常相似.
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舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽MP的部分理化性质测定
目的 对舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽MP成分进行纯化及部分理化性质测定.方法 采用色谱技术纯化蛇毒MP成分,质谱仪测定其相对分子质量(Mr);Edman降解法分析部分氨基酸序列,与已知成分比对;以卵磷脂为底物测定MP组分的磷脂酶A2活性;采用Bliss法测定MP对小鼠的急性毒性.结果 MP的M,为13 260,其N端16位氨基酸序列为NLYQFKNMIQCTVPSR,与已知蛇毒磷脂酶A2基本一致,并具有较强的磷脂酶A2活性;腹腔注射MP对小鼠的LD50值为14.3 mg/kg.结论 MP为一种眼镜蛇毒磷脂酶A2.
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中华眼镜蛇毒活性组分诱导内皮细胞凋亡的机制
目的:通过检测内皮细胞Bcl-2和caspase3的表达水平,探讨中华眼镜蛇毒活性组分(CCVAF)诱导内皮细胞凋亡的可能机制.方法:采用血管内消化法原代培养牛肺主动脉血管内皮细胞(BAVEC).实验分为不同浓度的CCVAF组(1.25,2.5,5,10 mg/L)和对照组(等体积的培养基).采用流式细胞仪检测CCVAF作用24h后备组BAVEC的Bcl-2表达水平;采用比色法测定caspase3的活性.结果:经CCVAF作用后,流式细胞仪测定备组均未见到有阳性峰出现在M1,抗凋亡蛋白Bcl-2表达并没有受到药物的影响.而与对照组相比,capase3活性在1.25mg/L组即出现升高,此后随浓度的增加而升高,呈剂量依赖性(r=0.929,P<0.05).各浓度组加入capase3活性抑制剂(Ac-DEVD-CHO)后,capase3活性明显降低,但仍然高于对照组(P<0.05).结论:CCVAF不影响内皮细胞Bcl-2的表达,而能够上调capase3的活性.其可能不经Bcl-2影响的线粒体所在的凋亡通路调节细胞的凋亡.
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舟山眼镜蛇毒细胞毒素的分离纯化及其体外抗肿瘤活性
目的从眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素-F(CTX-F)并鉴定其活性.方法应用凝胶过滤、离子交换柱色谱及疏水柱色谱等方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化CTX-F,以SRB法观察CTX-F对体外培养癌细胞的杀伤作用.结果眼镜蛇毒粗毒经凝胶过滤获得4个蛋白峰,将CTX所在第Ⅳ峰用阳离子交换柱色谱获A、B、C、D、E、F和G等7个组分,其中E、F和G具CTX活性,将F组分再经凝胶过滤和疏水色谱进一步纯化得不含磷酯酶A2 (PLA2)的CTX纯品,暂定名为CTX-F,它对多种癌细胞株有杀伤作用.结论应用凝胶过滤、离子交换和疏水色谱等方法可从眼镜蛇毒中获得不含PLA2的CTX,其组分F有抗肿瘤活性.
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中国眼镜蛇毒蛋白酶的分离、纯化及其对血小板聚集的影响
目的:从中国眼镜蛇毒中分离纯化出可水解纤维蛋白原的蛇毒蛋白酶,并观察其体内给药对血小板聚集的影响.方法:使用超滤的方法以及肝素亲和层析柱Heparin SepharoseCL-6B和凝胶层析柱Sephadex G150分离纯化中国眼镜蛇毒蛋白酶.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其纯度和分子量.比浊法测定血小板聚集率.结果:从中国眼镜蛇毒中纯化出具有水解纤维蛋白原活性的蛋白酶,经SDS-PAGE电泳测定为一条带,分子量为47.1kD.该蛋白酶低剂量(0.025mg/kg)、中剂量(0.05mg/kg)以及高剂量(0.1mg/kg)体内给药后,剂量依赖性地抑制ADP(10μmol/L)、胶原(100μg/ml)诱导的兔血小板聚集.结论:具有水解纤维蛋白原活性的中国眼镜蛇毒蛋白酶在体内表现出抑制血小板聚集的作用.
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广东眼镜蛇毒低分子量多肽的分离纯化与性质鉴定
目的 从广东眼镜蛇粗毒中分离纯化出色谱纯的低分子量多肽并对其部分性质进行鉴定.方法 采用化学沉淀法对蛇粗毒进行预处理,经 Sephadex G-50 凝胶过滤和 UND Sphere S 阳离子交换层析得到高纯度低分子量多肽,用SDS-PAGE及HPLC对产物纯度进行鉴定,并用SDS-PAGE和质谱法测定分子量,采用蛙心灌流法考察产物是否具有心脏毒性.结果 结果表明,经分离纯化后得到两种低分子量多肽GI2和GI3,均为单一组分,可达到色谱纯,SDS-PAGE法测得GI2分子量为14 300 Da,质谱法测得GI3分子量为6 725.8 Da,仅GI2具有心脏毒性,收率分别为9.5%和10.1%.结论 通过化学沉淀预处理,并经2次柱色谱可从广东眼镜蛇毒中分离得到两种色谱纯的低分子量多肽,且收率较高.
