人脂肪干细胞与猪尿路上皮细胞隔离共培养后向尿路上皮样细胞分化

目的 研究人脂肪干细胞与猪尿路上皮细胞体外隔离共培养后向尿路上皮样细胞转化的可行性.方法 从人抽脂术后脂肪组织中提取脂肪干细胞,同时从猪膀胱中获取尿路上皮细胞,两种细胞体外培养扩增后,通过"Trans-well"体系进行体外隔离共培养3周.倒置显微镜下观察脂肪干细胞形态变化.RT-RCP鉴定诱导后人脂肪干细胞中尿路上皮特异性标记Uroplakin-Ⅱ在基因水平的表达,免疫荧光鉴定AE1/AE3和Uroplakin-Ⅱ在蛋白水平的表达情况.结果 人脂肪干细胞与猪尿路上皮细胞体外隔离共培养3周后,倒置显微镜可见细胞折光性变强,细胞触角缩短,依然保持良好的增殖状态,但未见典型的尿路上皮细胞"铺路石样"改变.免疫荧光发现AE1/AE3和Uroplakin-Ⅱ均有表达,RT-PCR检测发现Uroplakin-Ⅱ基因表达阳性.结论 人脂肪干细胞与猪尿路上皮细胞隔离共培养后,可以表达成熟尿路上皮特异性标记,说明脂肪干细胞可以向尿路上皮样细胞分化.

膀胱灌注在肌层非浸润性膀胱癌治疗中的现状及展望

对尿路上皮肿瘤生物特性及生物力学等知识的不断探索,使膀胱灌注在肌层非浸润性膀胱癌( nonmuscle invasive bladder cancer,NMIBC)的治疗中有了长足的进展. 例如,靶向治疗提高了抗肿瘤药物的疗效,并降低了其副作用;纳米材料靶向转运在医疗领域的应用,使得抗肿瘤药物转运到尿路上皮细胞肿瘤中的量明显增加;基因治疗在靶向治疗中也开启了新的邻域;生物工程技术应用于卡介苗( bacillus CalmetteGuérin, BCG )的研制,其目标也转向减小BCG膀胱灌注的副反应,等等. 这些膀胱灌注治疗中的新进展,让笔者看到了降低非肌层浸润性膀胱癌进展和复发的希望.

膀胱尿路上皮细胞癌转移的治疗--转移灶手术效果的前瞻性研究

膀胱尿路上皮细胞癌转移的治疗--转移灶手术效果的前瞻性研究

小肠粘膜下膀胱尿路上皮和平滑肌细胞联合培养：组织工程学技术的 应用

　　小肠粘膜下层本身含有生长因子，能够在体内促 进膀 胱的再生。用标准酶消化或外植技术建立人膀胱上皮细胞和平滑肌细胞的原代培养，将培养 的细胞以1×105/cm2的密度点状种植于小肠粘膜下层，孵育3、7、14和28 d分别收获标 本。有5种不同的培养方法：将膀胱上皮细胞单独种植于小肠粘膜下层的粘膜表面、将平滑 肌细胞单独种植于粘膜表面、将平滑肌细胞种植于粘膜表面后1 h再将膀胱上皮种植进行分 层的联合培养、将平滑肌细胞种植于浆膜表面24 h后将膀胱上皮细胞种植于粘膜表面进行三 明治样培养、将膀胱上皮和平滑肌细胞混合后种植于粘膜表面联合培养。在指定时间收获标 本后用福尔马林固定，进行常规组织学分析，包括masson染色。研究特殊的细胞生长机制， 尤其注意细胞形态、细胞增殖和分层、细胞排列、假覆层尿路上皮的存在和基质的穿透。为 区分联合培养中的平滑肌细胞和 尿路上皮细胞，应用α-平滑肌肌动蛋白抗体和细胞角蛋白AE1/AE3进行了免疫组织化学分 析。体外培养结果在小肠粘膜下层尿路上皮细胞和平滑肌细胞三维空间生长。单独尿路上皮 和平滑肌细胞培养，细胞可以生长并分层，但没有或很少基质穿透。与此相比，分层培养、 混合培养和三明治样培养中平滑肌细胞的膜穿透明显增加，分层的和三明治样培养技术导致 有序的细胞排列、有规律的假覆层尿路上皮的形成和多层的平滑肌基质穿透增加。混合细胞 培养技术虽然使平滑肌细胞基质穿透作用明显，但没有使细胞有序排列。免疫组化研究证实 尿路上皮和平滑肌细胞维持表型标记物的表达。因此小肠粘膜下层在体外支持人膀胱尿路上 皮细胞的三维空间生长，采用不同的细胞种植技术进行联合培养，对将来在组织工程学中的 应用非常重要。

组织工程化膀胱壁复层结构的体外构建

目的 探讨膀胱缺损组织工程修复方法.方法 机械法去除膀胱黏膜层、肌层和浆膜层,仅保留膀胱黏膜下层.经SDS、Trixon-100和三蒸水处理去除细胞结构,制备获得膀胱脱细胞基质移植物(BAMG)作为支架材料.取成年猪膀胱壁,机械法分离膀胱肌层和黏膜层.以酶消化法分别获取膀胱尿路上皮细胞和平滑肌细胞.常规细胞传代和扩增后,将膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞分别接种在BAMG浆膜面和黏膜面.细胞-材料复合物体外培养4周并行组织学鉴定.结果 HE和Masson染色鉴定发现,BAMG以胶原成分为主,内部未见明显细胞残留.免疫荧光方法鉴定结果显示,膀胱尿路上皮细胞uroplakin Ⅱ阳性,膀胱平滑肌细胞α-平滑肌肌动蛋白阳性.体外培养4周后,BAMG浆膜面和黏膜面分别形成连续的复层结构尿路上皮层和膀胱平滑肌层,免疫组化显示平滑肌层α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,尿路上皮层广谱角蛋白表达阳性.结论 以膀胱脱细胞材料作为支架,尿路上皮细胞和膀胱平滑肌细胞作为种子细胞,能够在体外构建形成包含膀胱黏膜层及平滑肌层的复层膀胱壁结构.细胞-材料复合物的体外构建将为体内膀胱缺损的组织工程修复提供实验依据.

诱导多能干细胞向尿道上皮细胞分化体系的建立

目的 建立人脂肪干细胞(ADSCs)来源的诱导干细胞(iPSCs)分化为尿路上皮细胞的模型.方法 经活检获取患者脂肪,制备原代ADSCs,采用仙台病毒法建立ADSCs来源的人诱导干细胞系(hiPS),对hiPS细胞进行向尿路上皮细胞的诱导分化,并使用免疫组化和流式细胞仪检测分化效果.结果 脂肪干细胞高表达CD44,低表达CD45和CD105,使用仙台病毒法过表达脂肪干细胞OCT3/4,SOX2,KLF4和c-MYC的转录水平建立非整合的hiPS细胞系,证明其表达多能性标志,具有三胚层多向分化的能力.在相关因子和尿路上皮细胞专用培养基的处理下,诱导21d的hiPS细胞已出现上皮样结构,其表达尿路上皮细胞特异标志UPla达到70％以上,免疫组化见分化后的细胞大量表达尿路上皮细胞特异标志UPla,UPlb和UP2.结论 ADSCs源性iPSCs具备向尿路上皮分化的能力,该细胞系的建立有望为尿道缺损患者开展个体化的尿道修补治疗提供优质的种子细胞.

组织工程化尿路细胞-支架复合体的制备及其体外培养的初步研究

目的 利用组织工程方法在体外构建尿路细胞-支架复合体.方法 采用角朊细胞培养基用组织块法获得人尿路上皮细胞(UEC)和泌尿平滑肌细胞(USMC),以免疫荧光鉴定.制备胶原材料支架,以扫描电镜评价.经过体外培养和扩增后,将P3代UEC和USMC接种在胶原支架上.结果 胶原支架上的UEC和USMC经过体外培养1周后即可形成沿基膜排列的复层上皮结构.扫描电镜显示细胞-材料复合良好,免疫组化检测支架上的UEC和USMC的广谱角蛋白表达阳性.结论 运用组织工程方法能够在体外快速进行尿路复合细胞支架的初步构建,为进一步临床修复尿道缺损奠定技术基础.

膀胱灌注化疗的改良新方法

膀胱灌注化疗是低分级和低分期尿路上皮细胞恶性肿瘤、腺性膀胱炎、膀胱白斑术后预防复发首选局部治疗方法.术后膀胱内灌注的化疗可消除残余病变及原位癌,延缓肿瘤复发防止肿瘤浸润,从而提高病人生存率及生活质量[1].

留置导尿管病人需知

导尿产生尿路感染的危险因素很多:1引流系统不合规格;2女性患者;3糖尿病;④机体抵抗力低下;⑤尿道周围革兰氏阴性菌繁殖;⑥由于留置尿管,致病菌更易于粘附于尿路上皮细胞;⑦导尿管留置时间的长短(这是重要的因素).

胶原海绵支架体外构建组织工程膀胱黏膜

背景:组织工程膀胱黏膜层的构建在组织工程膀胱修复中占有重要的地位,但目前并没有合理的构建方法.目的:探讨胶原海绵支架复合猪膀胱尿路上皮细胞体外构建膀胱黏膜结构的可行性.方法:刮取猪膀胱黏膜层后用酶消化方式进行猪膀胱尿路上皮细胞原代培养,并进行尿路上皮细胞标志物免疫荧光和RT-PCR鉴定.制备疏松多孔的胶原海绵支架材料,将第3代尿路上皮细胞接种在胶原海绵支架上,体外培养4～8 d后观察尿路上皮细胞和胶原海绵材料的复合情况.结果与结论:原代培养的猪膀胱尿路上皮细胞呈"多角形"、"铺路石"样,以克隆团形式生长.免疫荧光鉴定AE1/AE3阳性,RT-RCR检测uroplakin-ⅠA、uroplakin-Ⅱ阳性.胶原海绵复合尿路上皮细胞体外培养4～8 d后,细胞在胶原海绵支架上生长良好,覆盖胶原材料的表面并长入材料内部,保持了尿路上皮细胞的特性.体外培养6 d时,尿路上皮细胞与胶原支架复合效果好,同时细胞数量也多.结果初步表明了胶原海绵复合膀胱尿路上皮细胞可以构建组织工程膀胱黏膜,且体外培养6 d为佳时间点.

在纤维蛋白凝块上诱导脐血间充质干细胞向膀胱尿路上皮细胞的分化

背景:在纤维蛋白凝块上诱导脐血间充质干细胞分化为膀胱尿路上皮细胞,尚无明确方案.目的:探讨脐血来源间充质干细胞在纤维蛋白凝块上分化为膀胱尿路上皮细胞的可能性.方法:实验组将脐血间充质干细胞接种于人工制备的脐血来源的纤维蛋白凝块上与胎儿膀胱尿路上皮细胞共培养,对照组将脐血间充质干细胞接种于人工制备的脐血来源的纤维蛋白凝胶上仅用DMEM/F1培养基培养.结果与结论:实验组的脐血间充质干细胞逐渐伸展呈多角形,细胞扁平变大,透射电子显微镜下具有膀胱尿路上皮细胞的超微结构,抗广谱角蛋白(AE1/AE3)免疫组织化学染色阳性.对照组的脐血间充质干细胞呈长梭形,抗广谱角蛋白(CK AE1/AE3)免疫组织化学染色阴性.提示在纤维蛋白凝块上诱导脐血间充质干细胞有分化为膀胱尿路上皮细胞的能力.

组织工程尿道粘膜的体外构建

目的:利用组织工程方法在体外构建形成尿道粘膜结构. 方法:酶消化法获得猪膀胱尿路上皮细胞(UC),以免疫荧光和RT-PCR方法进行UC鉴定.制备膀胱脱细胞基质移植物(BAMG)作为支架材料,以苏木精-伊红染色、Masson染色、免疫组化和扫描电镜进行评价.经过体外培养和扩增后,将P3代UC接种在BAMG上.结果:BAMG支架上的UC经过体外培养1周后即可形成沿基膜排列的复层上皮结构.扫描电镜显示细胞-材料复合良好,免疫组化检测支架上的UC广谱角蛋白表达阳性. 结论:运用组织工程方法能够在体外快速进行尿道粘膜上皮结构的初步构建,为进一步临床修复诸如尿道下裂、尿道狭窄等尿道缺损奠定技术基础.

膀胱尿路上皮血-尿屏障的结构及功台旨

膀胱是一个暂时性储尿容器,其为一个中空型球形器官.膀胱壁由内向外分为黏膜层、黏膜固有层、肌层以及浆膜层,浆膜层主要分布在有腹膜覆盖的区域.黏膜层由尿路上皮细胞层、黏膜肌层及固有膜层组成.血-尿屏障主要由尿路上皮层组成,其功能至关重要,若被破坏,尿中的溶质可以进入到黏膜固有层、黏膜肌层,甚至肌层而导致一系列不良反应.间质性膀胱炎的发生为膀胱尿路上皮屏障功能的重要性做了好的诠释.屏障功能的丧失将导致尿液成分进入到黏膜固有层并进而至肌肉层,而引起耻骨联合上和下腰痛以及尿频,尿急和尿痛.随着对膀胱尿路上皮结构与功能研究的深入,为治疗膀胱尿路上皮病变提供了一个更好的前景.

脱细胞异体真皮生物组织补片在小儿尿道重建中的应用

长段尿道狭窄或尿道缺损的修复仍是泌尿外科的一大难题,尤其是多次手术以后缺乏理想的尿道替代材料.目前临床上可采用的尿道修复材料有:患儿的自体材料、体外培养的尿路上皮细胞和人工材料等.但多少都存在一些问题.我们自2010年3月至2011年4月尝试采用组织工程学技术制作出的人同种异体真皮脱细胞基质,将其作为尿道重建的替代材料应用于临床,与相关文献对比观察初步的临床效果,现报告如下.

人永生化尿路上皮细胞系与胶原支架共培养的实验研究

目的 观察评价人永生化尿路上皮细胞系(immortalized human bladder urothelium cell line)SV-HUC-1在胶原支架中的生长情况,为进一步体内组织修复研究提供依据.方法 制备疏松多孔的胶原支架材料,SV-HUC-1传代扩增后,接种在胶原支架上,体外培养7d后取材,观察SV-HUC-1和胶原的复合情况.结果 SV-HUC-1呈“多角形”、“铺路石”样,以克隆团形式生长.HE染色显示胶原支架上的SV-HUC-1经过体外培养7d后即可形成沿支架表面排列的复层上皮结构,大量SV-HUC-1渗透到胶原的空隙内.扫描电镜显示细胞材料复合良好.结论 SV-HUC-1能在胶原支架上较好的生长,胶原可以作为理想的支架材料,进一步用于组织工程膀胱修复的研究.

表面活性蛋白A基因单核苷酸多态性与成年女性尿路感染易感性的关系

在反复发作的尿路感染(UTI)患者中,只有部分患者存在明显的易感或诱发因素.目前尿路上皮细胞的天然免疫功能在UTI中的作用逐渐引起了关注[1].表面活性蛋白A(SP-A)是早发现于肺组织的一种天然免疫分子,在肺部的宿主免疫和炎性反应调节方面起着重要作用;其基因的遗传变异导致了人群对多种肺部疾病不同的易感性[2].

糖尿病大鼠膀胱细胞凋亡的改变

目的:研究糖尿病大鼠膀胱细胞凋亡情况及其意义.方法:实验分为正常对照组和糖尿病组.用10周龄SD大鼠腹腔内注射1％链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠的动物模型.12周后取两组大鼠膀胱组织标本,原位细胞检测法检测细胞凋亡;免疫荧光方法检测CD146、PDGF-Rβ、NG-2表达;Western Blotting检测CD146、PDGF-Rβ表达.结果:与正常对照组比较,糖尿病组大鼠血糖升高,体质量减轻,膀胱湿重增加;细胞凋亡主要发生在糖尿病大鼠膀胱的尿路上皮细胞,而正常对照组未见明显尿路上皮细胞凋亡;两组大鼠膀胱组织中未见明显NG-2表达,CD146阳性表达细胞位于膀胱黏膜下层的血管壁及膀胱逼尿肌肌膜,PDGF-Rβ阳性表达细胞位于膀胱逼尿肌之间血管壁细胞及黏膜下血管壁;Western Blotting 检测结果显示,两组大鼠膀胱壁组织CD146、PDGF-Rβ的蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:糖尿病大鼠膀胱上皮细胞早期发即生凋亡改变,而周细胞早期凋亡不明显;上皮细胞的凋亡可能是糖尿病膀胱的治疗靶标之一.

尿路上皮细胞在老年SD大鼠前列腺导管内的表达情况

目的:探索老年雄性SD大鼠前列腺导管内是否存在尿路上皮细胞及其形态特点.方法:取5只老年雄性SD大鼠,水合氯醛麻醉后取尿道、前列腺及膀胱组织,完成病理切片和HE染色,观察前列腺导管内尿路上皮细胞的表达情况.免疫组化检测SD大鼠3种组织内CK7、CK20和尿斑蛋白Ⅲ(UroplakinⅢ,UPⅢ)的表达情况.另取10只老年雄性SD大鼠,同法将膀胱、前列腺腹侧叶和前列腺侧叶组织取出碎冰保存,随机分为实验组和空白对照组,每组5只大鼠,以UPⅢ阳性设门检测不同部位前列腺组织中是否存在UPⅢ阳性的细胞及其表达情况.结果:HE染色可观察到SD大鼠前列腺导管开口处存在形态与膀胱和尿道尿路上皮细胞相似的尿路上皮细胞,但该细胞未呈现典型的伞状细胞结构;其免疫组化CK7和UPⅢ阳性、CK20阴性.随着前列腺导管延伸至管腔底部,CK7和UPⅢ的表达逐渐减低,直至消失.流式细胞学检测结果表明前列腺腹侧叶及侧叶组织内有UPⅢ阳性的细胞,该细胞分别占各组织内细胞总数的(55.96 ± 3.85)%和(50.76 ± 3.99)%.结论:老年雄性SD大鼠前列腺导管内存在与膀胱尿路上皮相似的尿路上皮细胞,但该细胞未呈现典型的伞状细胞形态结构;该细胞免疫组化CK7和UPⅢ表达阳性.

体外诱导猪骨髓间充质干细胞向尿路上皮细胞分化的实验研究

目的 探讨体外诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向膀胱尿路上皮细胞分化的可行性研究,为组织工程膀胱的建立提供一种新的种子细胞来源.方法 抽取猪的骨髓液在体外行全血原代培养、扩增及鉴定骨髓间充质干细胞.用机械分离法获取膀胱尿路上皮组织,对其行原代培养、扩增、鉴定并提取尿路上皮细胞培养液.选取第三、四代的BMSCs和尿路上皮细胞分成四组:A组:BMSCs+尿路上皮细胞+表皮细胞生长因子；B组:BMSCs+尿路上皮细胞条件培养液+表皮细胞生长因子；C组:BMSCs+表皮细胞生长因子；D组:BMSCs 2 mL.结果 用流式细胞仪检测BMSC表面特异阳性标志物CD29、CD44,阴性标志物CD45,结果均为阳性.用角蛋白AE1/AE3单克隆抗体鉴定尿路上皮细胞及实验A、B组结果均为阳性,C、D组均为阴性.结论 骨髓间充质干细胞具有多向分化的能力,模拟体内的微环境可使BMSC向尿路上皮细胞分化.