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再生医学在尿道修复重建中的应用
尿道下裂、尿道狭窄等多种原因引起的尿道缺损是泌尿外科常见疾病,由于尿道组织有限,长段尿道缺损的修复极为困难.采用其他来源的组织如生殖器官或非生殖器官等自体组织修复,常引发毛发生长、移植物挛缩、狭窄、结石形成、憩室产生、腹腔脏器干扰等并发症;且会给取材部位造成创伤,导致病程延长.
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血管细胞外基质和尿道细胞外基质修复兔尿道缺损的比较研究
目的寻求较理想的尿道修复材料.方法切取10只家兔的腹主动脉和尿道各3cm,制备成血管细胞外基质(VECM)和尿道细胞外基质(UECM).另20只分别切除尿道2.5cm并随机分为VECM修复组和UECM修复组.两组均于修复术后10 d、3周、6周及24周行组织再生情况研究;另于术后10周、24周各取2只行膀胱尿道造影;24周两组各取2只行尿动力学检测和尿道镜检查.结果制备的VECM和UECM均为白色透明状,但VECM较UECM弹性和机械强度好.缺损修复术后10 d,基质中见单层上皮细胞且有血管长入ECM,基质和受体尿道连接处有炎性细胞浸润;3周时基质管腔已完全被上皮细胞覆盖;6周时可见平滑肌细胞再生,炎性细胞消失;24周后其组织结构与正常尿道组织结构一致.VECM修复组和UECM修复组相比其组织再生过程无差异.尿动力学检测VECM修复组和UECM修复组的膀胱容量分别为(30.2±1.6)ml和(32.1±1.4)ml、尿道高压分别为(15.27±1.36)mm Hg和(14.68±1.65)mm Hg、尿道低压分别为(12.49±1.23)mm Hg和(11.96±0.98)mm Hg,差异无统计学意义(P》0.05).膀胱尿道造影可见尿道壁完整光滑通畅,不能分辨移植区与正常组织,无尿液外渗,无梗阻及结石形成;尿道镜检查证实VECM修复组和UECM修复组尿道黏膜完整光滑,尿道内径及其形态正常.结论血管细胞外基质和尿道细胞外基质修复尿道缺损的组织再生规律基本相同,但血管来源广泛,制备的VECM较UECM弹性好、机械强度好,值得选择应用.
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内纵外螺旋双层结构管状尿道支架复合体修复尿道缺损的可行性及其血管化方法
目的 研究内纵外螺旋双层结构的管状尿道支架复合体血管化的方法,探讨采用其修复长段尿道缺损的可能性.方法 2014年8月至2015年10月选取雄性新西兰大白兔附睾旁脂肪,分离培养脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSC)及经过转化的平滑肌细胞为种子细胞,并采用重组血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因慢病毒转染.以小肠黏膜下层脱细胞基质和经过Ⅰ型胶原蛋白表面修饰的聚乳酸乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid,PLGA)膜为组织工程材料,构建内纵外螺旋双层结构的管状尿道支架,支架长度3.0cm.采用一次沉淀法将转染的ADSC和平滑肌细胞分别种植于尿道支架的内外层,构建管状尿道支架复合体.抽签法将27只清洁级雄性新西兰大白兔分为转染组(S1组)、带血管蒂转移皮管组(S2组)、单纯支架组(C组),每组9只.手术切除3.0 cm尿道构建尿道缺损动物模型.S1组采用尿道支架复合体直接修复尿道缺损;S2组将未转染慢病毒的ADSC和平滑肌细胞种植尿道支架后,包埋于实验动物腹股沟皮下血管旁,3周后采用带血管蒂转移皮管修复尿道缺损;C组直接采用尿道支架修复尿道缺损.术后4、8、24周分别选取每组各3只观察记录并发症发生情况和尿道造影检查结果,处死动物后留取修复段尿道标本行形态观察、扫描电镜观察以及HE、荧光示踪和相关蛋白免疫组化染色检查.结果 S1组术后尿瘘、尿道下裂及尿道狭窄相关性死亡各1只;尿道造影检查示尿道光滑通畅、粗细较均匀;病理检查见尿道黏膜修复良好,较平整光滑.S2组术后尿瘘和尿道狭窄相关性死亡分别为1只和2只;尿道造影示尿道壁粗糙、局部变细或扩张;病理检查见尿道黏膜下多量脂肪堆积,黏膜收缩.C组术后尿瘘、尿道下裂、尿道狭窄相关性死亡分别为1、3、3只;尿道造影示尿道粗细不均、弯曲狭窄,尿道黏膜修复不良,瘢痕狭窄.HE及CD31染色结果示S1、S2组尿道毛细血管增生活跃,血管形成丰富;C组血管形成较少.VEGF染色结果示3组的尿道上皮细胞层、平滑肌层及血管壁内皮细胞胞质均有充分表达,术后24周时表达减弱,以上皮细胞层减弱明显.CKpan染色结果示S1、S2组尿道从单层上皮发展为复层上皮,24周时形态结构类似正常尿道;C组尿道上皮细胞生长不良,层次单一、排列不整齐,术后24周时仍缺乏有效复层上皮.HE及α-SMA染色结果示S1、S2组平滑肌及肌动蛋白随时间逐渐增加;C组α-SMA着色稀少,术后24周时有所增加.HE及扫描电镜检查4周时显示PLGA被周围组织包裹,静电纺丝结构清晰;8周时PLGA明显吸收,静电纺丝逐渐降解;24周时PLGA不易发现,静电纺丝降解较完全.结论 重组VEGF基因慢病毒载体转染种子细胞是促进管状尿道支架血管化的有效方法之一.内纵外螺旋双层结构的管状尿道支架复合体可能是修复长段尿道缺损较合理的构建方式.
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诱导多能干细胞向尿道上皮细胞分化体系的建立
目的 建立人脂肪干细胞(ADSCs)来源的诱导干细胞(iPSCs)分化为尿路上皮细胞的模型.方法 经活检获取患者脂肪,制备原代ADSCs,采用仙台病毒法建立ADSCs来源的人诱导干细胞系(hiPS),对hiPS细胞进行向尿路上皮细胞的诱导分化,并使用免疫组化和流式细胞仪检测分化效果.结果 脂肪干细胞高表达CD44,低表达CD45和CD105,使用仙台病毒法过表达脂肪干细胞OCT3/4,SOX2,KLF4和c-MYC的转录水平建立非整合的hiPS细胞系,证明其表达多能性标志,具有三胚层多向分化的能力.在相关因子和尿路上皮细胞专用培养基的处理下,诱导21d的hiPS细胞已出现上皮样结构,其表达尿路上皮细胞特异标志UPla达到70％以上,免疫组化见分化后的细胞大量表达尿路上皮细胞特异标志UPla,UPlb和UP2.结论 ADSCs源性iPSCs具备向尿路上皮分化的能力,该细胞系的建立有望为尿道缺损患者开展个体化的尿道修补治疗提供优质的种子细胞.
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冻干无细胞膀胱黏膜下基质修复兔尿道缺损
目的探讨冻干无细胞膀胱黏膜下基质修复尿道缺损的效果.方法应用反复冻融-酶法及冷冻干燥技术制备冻干无细胞人体膀胱黏膜下基质.18只新西兰白兔建立尿道中段部分缺损模型,尿道缺损面积约1.0 cm×0.5 cm.其中14只兔作为实验组,以冻干无细胞膀胱黏膜下基质修补尿道缺损,术后1、2、3、4、8、12、24周分别取2只行逆行性尿道造影,观察尿道情况,并采取尿道组织进行大体、组织学及超微结构观察;4只兔作为对照组,未采用任何材料修补尿道缺损,直接缝合尿道海绵体包膜、皮下组织及阴茎皮肤,术后2、4周分别取2只行逆行性尿道造影,采取尿道组织进行大体观察.结果实验组14只兔均未发现明显的尿道狭窄.冻干无细胞膀胱黏膜下基质组织相容性良好,移植后无细胞膀胱黏膜下基质内有细胞长入,新生血管形成,术后2周无细胞膀胱黏膜下基质移植区完全上皮化.随着移植时间的延长,移植区胶原纤维排列由紊乱趋于规则.结论冻干无细胞膀胱黏膜下基质能够诱导尿道黏膜细胞迁徙、生长和上皮化,初步认为可以作为尿道缺损修复材料.
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自体带蒂小阴唇皮瓣修复远端尿道缺损5例
1995～2003年,我院采用自体带蒂小阴唇皮瓣修复尿道远端缺损5例,效果满意.
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影响重型尿道下裂手术疗效的因素分析
目的：分析影响重型尿道下裂手术疗效的因素。方法回顾性分析2012年1月～2013年12月在行重型尿道下裂手术治疗的患者102例的临床资料，分为成功组66例和失败组36例。分析影响重型尿道下裂手术疗效的因素。结果成功组年龄＜5岁、行一期手术、阴茎阴囊型、尿道缺损长度≤3mm、修补材料为包皮皮瓣、带血管蒂的阴囊皮瓣的比例均远高于失败组（P＜0.01）。结论影响重型尿道下裂手术疗效的因素有患者的年龄、手术方式、尿道下裂类型、尿道缺损长度以及尿道修补材料的选择。
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异种移植物尿道缺损修复重建的实验研究
在泌尿外科领域中,由各种原因(先天性、损伤及炎症)造成的尿道部分缺损和狭窄等病理损害,一直是临床治疗难题,其中重要的问题是修复或重建尿道的材料不够理想且来源受限.根据组织工程学原理,本课题以雄家犬尿道缺损动物模型为研究对象,以人体阴茎包皮为研究材料,制备成无细胞基质移植物,进行尿道缺损的修复重建.
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兔骨髓源单个核细胞诱导血管内皮祖细胞修复尿道缺损
背景:如何解决尿道替代修复材料来源和改善新尿道的血液供应已成为尿道修复与重建研究的瓶颈问题.目的:观察血管内皮祖细胞对尿道缺损修复后改善新尿道组织血液循环的效果.设计、时间及地点:组织工程体内实验,于2006-01/2008-02在郑州大学第一附属医院外总实验室完成.材料:3～5月龄雄性日本大耳白兔13只,1只用于制各骨髓源单个核细胞,剩余12只随机分为细胞修复组8只,模型组4只.方法:无菌抽取兔两侧髂前上嵴骨髓,Percoll法贴壁分离培养单个核细胞,加入含VEGF、bFGF的培养基进行体外诱导分化,待细胞长满培养瓶底后胰蛋白酶消化传代.两组兔均建立尿道缺损模型,将脱细胞处理的无菌新鲜人羊膜修剪成1 cm2 置于尿道缺损处,用0/6DG线将其两端分别与尿道残端连续缝合,形成抹道.细胞修复组将传至第3代的兔骨髓源单个核细胞浓度调整至1010 L-1,注射于新尿道两端的吻合口处,每处0.1 mL,0/6DG线间断缝合皮下组织覆盖成形后的尿道,并在近吻合口处和新修复尿道之中间处注射细胞悬液,每处0.5 mL;模型组在同样位点注射等量的空白细胞培养液.移植后4,12周制作尿道组织石蜡切片.主要观察指标:细胞形态及鉴定结果,修复后尿道组织的血管再生情况.结果:兔骨髓源单个核细胞在体外呈贴壁生长,4 d后生长加速,呈克隆样生长;第10天出现典型的铺路石样改变,并迅速表现出条索状、草束状生长形式:所培养的细胞表型由CD34+/CD133+/CD31+逐渐转变成CD34+/CD133+/CD31+.与模型组比较,移植后第4,12周细胞修复组尿道组织内毛细血管再生数量均明显多于模型组(t=-9.034～5.985,P＜0.01).结论:兔骨髓源单个核细胞可在体外诱导分化为血管内皮祖细胞,且血管内皮祖细胞对,改善尿道缺损修复后局部血液循环的效果非常明显.
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人尿源性干细胞的分离培养及生物学特性
背景:尿源性干细胞作为干细胞家族新兴的群体,在组织工程构建方面越来越引起人们的重视.目的:研究尿源性干细胞的培养方法,对尿源性干细胞进行生物学鉴定.方法:取健康成人清洁尿液,将其离心、分离、培养、传代获取尿源性干细胞,用MTT法检测细胞的生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,并对细胞进行成骨、成脂诱导能力鉴定.结果与结论:①从尿液中分离获取得到生长迅速并大量增殖的尿源性干细胞,对该细胞进行培养传代,细胞生长曲线成"S"型;②尿源性干细胞表达间充质干细胞表面标志物 CD29、CD44、CD73、CD90,保持了干细胞的活性;③尿源性干细胞有向成骨、成脂细胞分化的生物学特性;④结果表明,尿源性干细胞有很强的增殖分化能力,作为一种经济便利无创的细胞来源,为以后研究尿道缺损、器官再造等提供巨大的便利.
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膀胱脱细胞胶原基质复合血管内皮生长因子修复兔尿道缺损
背景:采用膀胱无细胞基质作为游离移植物修复尿道缺损,诱导尿道再生取得一定的成果,但该方法仍未能从根本上解决移植物血管再生不足的问题.目的:观察复合血管内皮生长因子的异种膀胱脱细胞基质修复兔尿道缺损的效果.方法:将30只成年新西兰大白兔随机分为5组,每组6只,模型组、对照组、实验组均制作尿道缺损模型,随后对照组、实验组分别采用猪膀胱脱细胞基质、复合血管内皮生长因子的猪膀胱脱细胞基质进行修复,同时设立正常组、假手术组.术后4,12周分批处死动物,进行尿道造影、尿流率及免疫组织化学检测.结果与结论:①实验组术后4,12周的平均尿流率高于模型组、对照组(P<0.05),与正常组、假手术组比较无差异;②术后12周尿道造影显示,实验组尿路线条流畅;模型组、对照组尿路线条欠流畅;③苏木精-伊红染色显示,模型组胶原纤维细胞较多,纤维排列紊乱,有较多淋巴细胞浸润;实验组胶原基质基本降解,新生胶原纤维排列规律,其间血管较多,未见血管瘤等;对照组见团块状胶原沉积,视野内血管较少;④术后12周Masson染色显示,实验组胶原组织沉积明显少于对照组、模型组(P<0.05),接近正常组和假手术组(P>0.05);⑤术后12周CD31染色显示,实验组新生血管数量明显多于对照组、模型组(P>0.05),接近正常组和假手术组(P>0.05);⑥术后12周a-SMA免疫组织化学染色显示,实验组再生肌肉含量明显高于对照组和模型组(P<0.05),接近正常组和假手术组(P>0.05);⑦结果表明,复合血管内皮生长因子的异种膀胱脱细胞基质修复兔尿道缺损,可促进移植物局部血管新生,提高再生尿道肌肉含量,加速局部胶原降解,改善尿道再生微环境,促进尿道更好地再生.
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血管内皮生长因子修饰膀胱脱细胞胶原基质修复尿道缺损
背景:研究表明将血管内皮生长因子修饰的膀胱脱细胞胶原基质作为支架用于尿道缺损中,有助于缺损部位修复,促进尿道再生,但不同实验的结果存在争议.目的:探讨血管内皮生长因子修饰的膀胱脱细胞胶原基质修复家兔尿道缺损的效果.方法:将48只家兔随机分为4组,每组12只,正常组不进行任何处理;模型组、对照组、实验组建立尿道缺损模型,模型建立后即刻,对照组与实验组缺损部位分别植入膀胱脱细胞胶原基质、血管内皮生长因子修饰的膀胱脱细胞胶原基质,模型组不植入任何材料.建模后1个月,检测各组家兔尿流率、大尿道压,对尿道缺损部位进行苏木精-伊红染色,观察尿道组织修复情况及微血管数量.结果与结论:①建模后1个月,实验组尿流率、大尿道压水平高于模型组、对照组(P<0.05),与正常组比较差异无显著性意义;模型组尿流率、大尿道压水平低于正常组、对照组(P<0.05);②建模后1个月,正常组尿道组织清晰,上皮细胞排列规律;模型组尿道组织相对模糊,上皮细胞排列无序,大量炎性细胞浸润;实验组黏膜上皮修复良好,胶原基质部分降解,可见新生血管,未见炎性细胞浸润;对照组黏膜上皮修复一般,未见明显新生血管,少许炎性细胞浸润;③建模后1个月,实验组微血管数量高于其他3组(P<0.05),对照组微血管数量高于模型组(P<0.05);④结果表明,采用血管内皮生长因子修饰的膀胱脱细胞胶原基质修复家兔尿道缺损,可促进局部新生血管生成,改善尿道再生所需环境,促进尿道再生.
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多孔丝素复合脂肪间充质干细胞支架修复兔尿道缺损能促进血管的形成
背景:应用脂肪间充质干细胞复合丝素支架修复尿道缺损,国内外尚无公开报道.目的:观察脂肪间充质干细胞复合多孔丝素支架在修复兔尿道缺损中促进血管形成的作用.方法:取兔附睾处脂肪垫组织,分离培养脂肪间充质干细胞.将大白兔按随机数字表法设尿道缺损对照组、多孔丝素膜修复组、脂肪间充质干细胞复合多孔丝素膜修复组.结果与结论:第3 代脂肪间充质干细胞CD44、Vimentin 均呈阳性表达.造模后2,4,6 周苏木精-伊红染色结果显示,脂肪间充质干细胞复合多孔丝素膜组和多孔丝素膜组较尿道缺损对照组、脂肪间充质干细胞复合多孔丝素膜组较多孔丝素膜组血管形成多.造模后4 周,应用FⅧ-RAg免疫组织化学染色法计数微血管密度,脂肪间充质干细胞复合多孔丝素膜组和多孔丝素膜组高于尿道缺损对照组(P < 0.05),脂肪间充质干细胞复合多孔丝素膜组高于多孔丝素膜组(P < 0.05).提示脂肪间充质干细胞型丝素支架在尿道缺损的修复中能显著促进血管的形成、生长.
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1例睾丸鞘膜加阴囊皮治疗医源性尿道缺损的护理
尿道先天畸形、后天损伤或因疾病需要重建尿道时,常因缺乏适当的重建材料或使用材料不当,使重建手术困难甚至失败[1].根据不同患者病情来具体制定适合其本人的佳手术方案是手术成功的关键.睾丸鞘膜加阴囊皮作为重建材料在国内用于成人尿道缺损重建手术缺乏临床指南可遵循.
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阴道粘膜瓣翻转修补术修补尿道部分缺损
尿道部分缺损多由外伤或手术中损伤引起,形成尿道阴道瘘,由于尿道组织薄弱,一旦缺损,可利用的组织少,手术修补难度大,成功率远远低于膀胱阴道瘘,且易形成尿道狭窄.对此,我们采用阴道粘膜瓣翻转术修补部分尿道缺损,取得了较好的效果,现报道如下.
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脂肪干细胞复合多孔丝素材料修复兔尿道缺损
目的 探索脂肪间充质干细胞(ADMSCs)复合多孔丝素膜(PSFS)对尿道缺损的修复效果.方法 建立雄性新西兰大白兔尿道缺损模型后分为3组,每组13只.A组用PSFS修补,B组用BrdU标记ADMSCs复合PSFS修补,C组为尿道缺损对照.手术前后行尿道造影.术后2、4、6周取修复段尿道行组织学检查,免疫组织化学染色检测BrdU标记ADMSCs、广谱角蛋白阳性细胞及巨噬细胞情况.结果 术后C组尿道狭窄和尿屡的并发症总发生率为76.92% ,高于A组的23.07% 和B组的15.38% (P<0.05).组织学观察C组的血管、上皮细胞层、平滑肌重建少;A、B组重建多、B组多于A组.BrdU标记ADMSCs在3时间点缺损区丝素膜中散在可见;广谱角蛋白染色C组缺乏尿道上皮的复层柱状上皮形态,无乳突状黏膜存在;A、B组与正常尿道黏膜相似,有较多乳突状结构;术后4周巨噬细胞表达B组比A组少[(11.66±1.58)/HP vs.(13.88±2.08)/HP](P<0.05).结论 ADMSCs复合PSFS具有促进尿道缺损修复的作用.
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Snodgrass法加Duckett法治疗重度尿道下裂的临床应用
Snodgrass法(尿道板纵切卷管尿道成形术)和Duckett法(横行包皮岛状皮瓣尿道成形术)目前已被广泛应用于一次修复尿道下裂的手术中。但对于尿道缺损长的重度尿道下裂，单用上述任一种术式就不能奏效。我们近年来应用Snodgrass法加Duckett法治疗重度尿道下裂6例，效果良好，现报道如下。……
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包皮岛状皮瓣联合阴囊纵隔皮瓣成形术治疗小儿重度尿道下裂31例分析
我院1990年3月至2004年4月,对31例尿道缺损长度＞5 cm小儿重度尿道下裂患儿,采用包皮岛状皮瓣联合阴囊纵隔皮瓣行尿道成形术.现将结果报告如下.
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游离膀胱黏膜一期尿道成形术治疗尿道下裂体会
自1986年7月～2002年7月,笔者采用游离膀胱黏膜一期尿道成形术治疗尿道下裂,治疗了26例先天性尿道下裂患者,疗效满意,介绍如下.1 临床资料本组26例,平均年龄20.6(16～22)岁,其中阴茎型19例,阴茎阴囊型7例,均有不同程度的阴茎弯曲,行阴茎伸直术后,尿道缺损3～8cm.经一期手术获得满意矫治23例.2例术后出现尿瘘,经再次手术修补后治愈.1例成形尿道坏死,手术失败,25例患者均经2～16年随访,阴茎外型美观,性生活正常,排尿通畅.
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阴囊纵隔带蒂皮瓣Ⅰ期修复尿道下裂
尿道下裂是常见的泌尿系先天性畸形，修复方法约200余种。我院自1990年以来采用阴囊纵隔带蒂皮瓣Ⅰ期修复尿道下裂24例，疗效满意，现报告如下。临床资料本组24例，年龄4～14a，平均7.5a。阴囊均发育良好，阴茎型8例，阴茎阴囊16例。修复长度2～5cm，平均4cm。出院时一期手术成功修复21例，并尿瘘2例，尿道外口狭窄1例，再手术后治愈。手术方法氯胺酮全麻或持续硬膜外麻醉下，阴茎头缝牵引线。距冠状沟0.5 cm处环形切口，于Buck筋膜浅层向阴茎根部剥离包皮，切除腹侧及尿道旁的纤维索带，彻底矫正阴茎下曲。测量尿道缺损长度，从阴囊纵隔切取矩形阴囊带蒂皮瓣，宽度1.5～2.0 cm，长度2～6cm，瓣长一般至正位开口再多取0.5cm，不应有张力。同侧阴囊皮肤按原设计线切开至肉膜，仔细分离到阴囊隔，以同法做对侧切口，将阴囊隔血管蒂皮瓣提起，对光相视可清晰看见隔内血管丛。
