一种双抗体夹心ELISA检测热休克融合蛋白方法的建立

MUC1蛋白在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞都呈现高水平表达.MUC1蛋白的表位肽VNTR,是诱生MUC1特异性免疫应答的靶点;采用MUC1 VNTR多肽研制出的生物制剂能刺激小鼠抑制表达MUC1肿瘤细胞的生长[1].

不同年龄人群血清不定型流感嗜血杆菌外膜蛋白 P6及其 T-B 联合表位肽抗体水平

目的：研究不同年龄人群血清不定型流感嗜血杆菌（ nontypeable Haemophilus influen-za， NTHi）外膜蛋白P6及其T-B联合表位肽抗体水平，为NTHi 外膜蛋白P6多抗原肽疫苗的研究提供科学依据。方法构建NTHi P6原核表达系统，纯化重组蛋白P6，同时采用Epitope prediction 1．0软件和ANTIGENIC程序预测NTHi P6的T表位和B表位，合成T-B联合表位肽。以P6及其T-B联合表位肽为抗原，采用ELISA法检测血清中相应抗体水平。研究对象为605例来我院体检者，年龄范围为1天～103岁，组间抗体水平比较采用Mann-Whitney U检验，相关性采用Pearson相关分析法。结果研究中预测到NTHi P6的T-B联合表位肽有4条，分别是P6-2、P6-61、P6-95和P6-122。＜1个月组血清NTHi P6及其上述表位肽抗体水平均显著低于1～6个月组（ P均＜0．001）和7个月～3岁组（P均＜0．001）。7个月～3岁组 P6及其各表位肽抗体水平高，显著高于4～6岁组（P 均＜0．01），4～6岁组又显著高于7～14岁组（P均＜0．01），其他各相邻年龄组间5种抗体差异较小。血清表位肽P6-2、P6-61、P6-95和P6-122抗体水平与P6抗体水平均显著相关（ P＜0．0001）。结论本研究预测的NTHi P6的T-B联合表位肽与P6在人血清中的抗体分布高度一致，提示其具有良好的免疫原性；7个月～3岁组儿童血清中P6及其表位肽抗体水平高，可能与该年龄段NTHi感染率高有关。

MHC-表位肽四聚体技术在病毒性肝炎研究中的应用

可溶性MHC-肽四聚体是根据T细胞活化的双识别原理,用生物工程技术将MHC-Ⅰ类分子重链α与β2微球蛋白在体外组装,并结合抗原表位肽,形成一个能够与相应TCR特异性结合的单体,再将4个单体组装在一起,称为四聚体.四聚体用荧光染料标记,供流式细胞仪检测,就可以用于具有特定TCR的T细胞的研究.在病毒性肝炎的研究中,四聚体技术可以直接检测抗原特异性CTL数量,在感染急性期抗原特异性CTL比恢复期高,肝炎自愈者高于慢性感染,肝内高于外周血,但明显低于其他病毒性疾病.四聚体标记联合其他膜表面分子的标记(或细胞内细胞因子染色),可以评价抗原特异性CTL的功能状态,还可以联合一些特殊的荧光染料,评价抗原特异性CTL的分裂增生能力.

抗原表位特异性CTL在慢性HBV感染肝损伤和抗病毒中的作用研究

目的:探讨抗原表位特异性CTL在肝炎发作中的抗病毒和肝损害作用.方法:用四个HBV抗原表位肽四聚体对外周血中抗原特异性CTL进行检测,(HBV抗原表位肽分别为HBcAg18-27,序列为FLPSDFFPSV(C18),HBsAg183-191序列为WLSLLVPFV(E183),HBeAg335-343序列FLLTRILTI(E335),多聚酶P的575-583序列为FLLSLGIHL(P575))检测慢性乙型肝炎患者肝炎发作时病毒抗原表位特异性CTL出现频率,统计分析抗原表位特异性CTL频率与病毒载量和血清ALT水平的相关关系.将所有检测的病例按照血清ALT水平高低重新分组进行对比,分析各组间抗原表位特异性CTL频率的差异.结果:36例慢性HBV感染患者抗原表位特异性CTL检测阳性33例(91.7%),HBeAg183-191表位特异性CTL频率高于其他三个(P＜0.05).统计分析抗原表位特异性CTL频率与病毒载量和血清ALT水平相关性不显著;分组对比发现血清ALT升高5-10倍组多个抗原表位特异性CTL水平高于其他组(P＜0.05).结论:慢性HBV感染患者外周血中存在抗原表位特异性CTL,但特异性CTL的存在并不能代表保护性免疫.认为慢性HBV感染肝炎发作时抗原表位特异性CTL反应增强,抗原表位特异性CTL在肝炎发作过程中具有抗病毒和肝组织损害双重作用,肝组织损害可能比较轻微,严重的肝损害可能是非特异性细胞造成.

慢性HBV感染肝炎突发患者外周血病毒抗原表位肽特异性CTL的数量研究

目的:了解慢性乙肝患者肝炎突发时抗原特异性CTL反应水平.方法:用四个HBV抗原表位肽四聚体(HBcAg18-27,HBsAg183-191,HBeAg335-343,多聚酶P的575-583)对外周血中抗原特异性CTL进行检测,分析健康献血员和慢性乙型肝炎患者病毒抗原表位肽特异性CTL的出现频率.结果:6例HLA-A2阳性献血员,6例HLA-A2阴性的HBV感染患者,抗原表位肽特异性四聚体阳性细胞占CD8细胞的高百分比为0.02%,以0.02%为四聚体检测域值.29例HLA-A2阳性慢性HBV感染患者,其中27例外周血四聚体细胞阳性,检出率93.1%.肝功能ALT在正常上限5-10倍者四聚体阳性细胞比例描写高于其他组(P＜0.05).结论:HLA-表位肽四聚体技术直接检测外周血中抗原特异性CTL具有特异性高,敏感性强的特点.大部分慢性HBV感染患者体内仍存在抗原特异性的CD8细胞,而且肝炎突发时抗原特异性细胞数量增加.

GPC3特异性HLA-A11限制的T淋巴细胞表位肽免疫活性检测

目的：设计合成人类白细胞抗原（HLA）-A11限制性T细胞识别的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）多肽，并检测其免疫原性和反应性。方法利用BIMAS 和SYFPEITHI评分系统评价GPC3多肽与HLA-A11分子的结合能力，预测出相应的抗原谱，合成HLA-A1101限制性GPC3多肽库；流式细胞仪检测HCC患者HLA-A11分子的表达；多肽刺激外周血淋巴细胞，酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测T细胞对GPC3多肽的反应性。结果流式细胞仪检测32例HCC患者，7例HLA-A11分子表达阳性（21.9%）；ELISPOT检测发现17例（53.1%）HCC患者的T细胞应答阳性，7例（21.9%）HLA-A11表型检测阳性的 HCC患者，T细胞应答结果成强阳性。HLA-A11限制性GPC3多肽应答率符合人群中相应基因位点的自然表达率。结论 GPC3多肽设计合理，具有良好的免疫原性和反应性。

三种不同抗原对小鼠γδT细胞体外扩增的比较

目的 比较异戊烯焦磷酸(IPP)、热休克蛋白70 (HSP70)和表位肽(EP6)对小鼠脾脏γδT细胞体外扩增的差异.方法 2011年1月-2015年5月于北京协和医院及北京世纪坛医院选取健康雄性SPF级C57 BL/6小鼠32只,分为16组,每组2只.提取并分离小鼠脾脏γδT细胞,分为对照组、IPP组、HSP70组和EP6组,每组再按浓度及干预方式(连续性刺激及单次刺激)的不同进行分组,IPP浓度分为1.25 ng/ml、2.5 ng/ml、5 ng/ml,HSP70浓度分为6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、25μg/ml,EP6浓度分为0.05 μg/μl、0.1 μg/μl、0.2μg/μl,连续性刺激即每隔2～3日换液50％并补充所换液体中相应的抗原,单次刺激组即不需补充所换液体中的抗原,共培养10 d.检测对照组与不同浓度抗原、不同干预方式在培养的第0天(D0)、第3天(D3)、第7天(D7)和第10天(D10)的γδT细胞比例.结果 不同浓度的抗原作用γ趼细胞后第3天出现扩增峰值,达峰时抗原由小到大各浓度的增殖百分比分别为:IPP组(5.46％±0.01％、5.23％±0.01％、5.08％±0.08％),HSP70组(7.43％±0.11％、4.48％±0.07％、7.78％±0.07％),EP6组(3.80％±0.10％、6.22％±0.13％、8.42％±0.11％).达峰时IPP组1.25 ng/ml的扩增效果较2.5ng/ml和5.O ng/ml明显升高(5.46％ ±0.01％ vs.5.23％±0.01％、5.08％±0.08％,P＜0.05).3组γδT细胞的扩增效果不随抗原浓度增加而升高,随培养时间的延长而降低.浓度不变干预方式不同时,连续性刺激组和单次刺激组均在第3天出现扩增峰值,连续性刺激组第3天的增殖百分比分别为:IPP组6.38％±0.58％、HSP70组4.27％±0.26％、EP6组5.41％±0.11％;单次刺激组第3天的增殖百分比分别为:IPP组3.60％±0.27％、HSP70组4.54％±0.16％、EP6组3.20％±0.11％;达峰时IPP组和EP6组均出现连续性刺激组扩增百分比大于一次性单次刺激组(P＜0.05).结论 小鼠模型中抗原体外扩增脾脏γδT细胞时,培养后第3天为扩增的达峰时间,且抗原连续性刺激扩增效果优于单次刺激.

WT1蛋白CTL表位肽基因载体的构建与鉴定

目的 构建WT1 (Wilms' tumor gene 1)蛋白CTL表位肽基因载体,并检测其在293T细胞中的转录.方法 设计分别含WT1-126肽、WT1-235肽以及这两种肽的基因载体,并加入Th通用表位Pan-DR-Th(PADRE),应用蛋白酶体切割软件PAProC和NetChop优化各表位和间隔序列,DNA疫苗在线预测工具DyNAVacS优化真核密码子后,人工合成核苷酸序列,分别插入pUC57载体,构建pUC57-WT1质粒,测序鉴定后,酶切回收各目的片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒,转染293T细胞,RT-PCR检测各目的基因在293T细胞中的转录.采用无内毒素质粒大量提取试剂盒提取各重组质粒,采用紫外分光光度计测定质粒的纯度和浓度.结果 各重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证实构建正确；重组质粒携带的目的基因可在293T细胞中成功转录；各重组质粒DNA的纯度均合格,浓度在864.6 ～ 883.9 μg/ml之间.结论 成功构建了WT1蛋白CTL表位肽基因载体,并能在真核细胞中正常转录,为下一步在小鼠体内探讨特异性不同的CTLs群发挥抗肿瘤作用的机制奠定了基础.

039 接种包裹于pH敏感脂质体的表位肽能产生Th-1介导的CD8+效应T细胞

021 HIV-gp160、HIV-1 Env CTL表位肽(E7)与粘膜佐剂LT(R192G)联合鼻腔免疫的效果

基于抗原表位的抗蛋白质抗体制备新方法

为建立一种基于抗原表位的抗蛋白质抗体制备新方法.以T7噬菌体作为展示载体,在其表面展示蛋白质的抗原表位肽,提取重组噬菌体作为免疫原免疫动物,通过ELISA、Western blot和细胞免疫荧光技术检测抗体的滴度及特异性.结果表明,以展示蛋白质抗原表位的T7噬菌体免疫动物,得到的抗体能特异识别相应的表位肽.其中针对Pifl-α抗原表位的抗体,还能特异识别Pifl-α蛋白.结论是,表面展示小肽的T7噬菌体具有很好的免疫原性,如果展示的小肽确为蛋白质抗原表位,则可作为完整蛋白质抗原的替代抗原免疫动物来制备识别完整蛋白的抗体.

结核分枝杆菌Rv0440 CTL表位肽的免疫原性研究

目的 体外鉴定结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Rv0440蛋白序列中表位肽362 370 aa和369-377 aa的HLA A*0201限制性CD8+ CTL表位的免疫原性,为基于表位的结核疫苗研究提供实验依据.方法 根据T2细胞HLA-A* 0201分子与多肽结合力分析实验结果,选取结核分枝杆菌Rv0440蛋白质氨基酸序列中对HLA-A* 0201分子高亲合力的Rv0440 1(362-370 aa,KLQERLAKL)和Rv0440-2(369 377 aa,KLAGGVAVI)作为候选表位肽.用候选表位肽刺激PPD(+++)健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)检测细胞分泌IFN γ的水平.用候选表位肽诱导特异性CTL细胞,检测特异性CTL细胞对负载表位肽的T2细胞的杀伤活性,观察Rv0440-1和Rv0440 2的HLA-A* 0201限制性CD8+ CTL表位的免疫原性.结果 ELISPOT实验结果显示,表位肽Rv0440-1能够明显诱导HLA-A* 0201(+)、PPD(+++)健康志愿者PBMC分泌IFN γ(P＜0.05);且表位肽Rv0440-1负载DC诱导的CTL在效靶比为10:1时对负载相应表位肽的T2细胞的特异性杀伤活性高于对照组(P＜0.05);与对照组相比,表位肽Rv0440 2没有诱导能力.结论 表位肽Rv0440-1(362-370 aa,KLQERLAKL)具有良好的免疫原性,是有效的结核分枝杆菌的HLA-A*0201限制性CTL表位.

透明带抗原表位肽的合成及其诱导的特异性抗体水平

目的 化学合成透明带抗原表位肽,检测其在小鼠体内诱导的特异性抗体水平.方法 用标准Fomc方案在430A自动肽合成仪上合成ZP2121-140表位肽,并与等量完全弗氏佐剂混悬后左胫前肌免疫雌性BALB/c小鼠.在不同时间段收集小鼠阴道冲洗液,离心取上清,检测特异性IgA抗体;不同时间段断尾取血,分离血清,检测特异性IgG抗体.结果 在430A自动肽合成仪上成功合成了20肽,并经HPLC纯化、质谱鉴定证实其纯度达85%以上;抗原合成肽免疫小鼠后,血清中特异性IgG抗体滴度高达1:3000,阴道冲洗液中特异性IgA抗体滴度高达1:500.结论 化学合成透明带抗原肽能在小鼠体内诱导出高滴度特异性抗体,从而为研制透明带避孕疫苗提供实验基础.

肾癌组织中卷曲螺旋结构域蛋白62的HLA-A2表位肽的筛选和鉴定

目的 筛选和鉴定肾癌组织中癌睾抗原卷曲螺旋结构域蛋白62(CCDC62)的人类白细胞抗原(HLA)-A2的特异性细胞毒性T细胞(CTL)的表位肽,为肾癌的免疫治疗提供实验基础.方法 通过NetCTL1.2软件预测CCDC62的HLA-A2限制性表位,对得分>1.0的表位肽进行合成.结合力实验检测候选表位肽与T2A2细胞表面HLA-A2分子的结合强弱,细胞内因子染色检测候选表位肽诱导CTL分泌干扰素-γ(IFN-γ)的能力.比较实验组的表位肽与对照组的差异来判断表位肽的活性.结果 表位肽CCDC62-P137和CCDC62-P141有较好的HLA-A2结合力.细胞内因子染色表明表位肽CCDC62-P137相比于对照组能诱导肾癌的CTL分泌更多的IFN-γ.结论 表位肽CCDC62-P137有较高的HLA-A2分子亲和力和诱导产生更多IFN-γ的能力,是CCDC62在肾癌组织中的HLA-A2限制性CTL候选表位肽,为肾癌的抗肿瘤多肽治疗提供实验基础.

人工合成树状串联hTERT表位肽对mDC表型和功能的影响

目的 通过对树状串联hTERT表位肽(MAP)与无肽刺激组髓样树突状细胞(mDC)的相关检测,研究MAP肽对mDC的表型和功能的影响.方法 人工固相合成四分支的MAP肽,免疫磁珠分选mDC,流式细胞技术检测相关表面分子.ElISA分别检测两组mDC培养基的IL-12p70含量,并作统计学分析.结果 人工合成MAP肽纯度高(95.26 %),免疫磁珠分选mDC纯度为72.59 %,相比于无肽刺激组mDC,MAP肽刺激组成熟(培养第9天)时MHCⅡ类分子为83.90 %、MHCⅠ类分子为91.08 %,CD86:77.03 %,CD83:92.16 %;IL-12p70的含量也大于无肽刺激组,且有统计学差异.结论 人工合成hTERT的MAP肽能足够强的激活mDC,刺激其成熟和功能的表达,可作为mDC抗肿瘤疫苗的刺激肽结构.

癌胚抗原CEA168～183多表位肽的免疫原性研究

本研究旨在通过免疫信息学手段预测癌胚抗原(CEA)表位,选择富含T、B细胞免疫优势表位的短肽并对其免疫原性进行分析.一、材料与方法1.材料:限制性核酸内切酶Xhol Ⅰ、BamH Ⅰ、T4连接酶、核酸相对分子质量标准DNA Marker和预染蛋白Marker购自MBI公司.6×His-Tag单克隆抗体购自Bethyl公司.BALB/C小鼠,6～8周,雄性.

HLA-A*0201限制性GPC3表位肽的初步预测与筛选

目的:筛选HLA-A* 0201限制性GPC3优势表位肽,为肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)特异性的免疫细胞治疗提供新的靶标.方法:通过表位预测网站初步筛选HLA-A * 0201限制性GPC3表位肽,T2细胞结合实验筛选优势表位肽.结果:通过三大常用的表位预测网站,共筛选了13个评分较高的表位肽,化学合成表位肽,采用T2细胞结合实验显示,有4个表位肽与HLA-A2呈现较高亲和力.结论:抗原表位预测网站结合T2细胞结合实验能初步筛选亲和力较高的HLA-A* 0201限制性GPC3表位肽,可能用于HCC特异性CTL治疗的候选标靶.

结核杆菌热休克蛋白质70作为乙型肝炎核心抗原细胞毒性T淋巴细胞表位肽载体的研究

目的探讨结核杆菌热休克蛋白质70(TB.HSP70)作为乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位肽载体,诱导HBV特异性免疫应答的可能性.方法体外观察重组TB.HSP70-CTL融合蛋白质和TB.HSP70/CTL复合物诱导慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞增殖以及HBV特异性细胞毒活性;以Balb/C小鼠为体内研究对象,行流式细胞术分析免疫后小鼠外周血和脾细胞中CD4+与CD8+T淋巴细胞及自然杀伤(NK)细胞的比率,并观察能否诱导HBV特异性免疫保护作用.结果体内外研究表明TB.HSP70-CTL融合蛋白质和TB.HSP70/CTL复合物能有效地诱导HBV特异性细胞毒活性,体内能激活CD4+与CD8+T淋巴细胞及NK细胞增殖.在体内,TB.HSP70-CTL融合蛋白质较复合物能更有效地激活免疫应答,其杀伤率为28.9%;CD8+T淋巴细胞在脾细胞中比率为43.9%,NK细胞为13.6%.而单纯的TB.HSP70和CTL表位肽并不能有效地引起机体的免疫应答.结论 TB.HSP70能够作为乙型肝炎核心抗原CTL表位肽的载体,提高小分子表位肽的免疫原性.

空肠弯曲菌PEB1的B细胞免疫优势表位的鉴定及保护效果的评价

目的 利用表位预测分析技术筛选空肠弯曲菌(C.jejuni)黏附蛋白PEB1的B细胞免疫优势表位,并评价其免疫保护效果.方法 采用氨基酸步移策略,合成18 mer氨基酸重叠肽段.ELISA系统筛选鉴定PEB1的B细胞免疫优势表位.采用KLH偶联免疫优势表位肽免疫BALB/c小鼠,ELISA测定优势表位肽诱导的IgG抗体效价.末次免疫后7d,经口灌胃感染C.jejuni 11168,在感染后的28 d,定量检测感染攻毒后各组小鼠的空肠组织C.jejuni的定植量以及qRT-PCR技术检测炎性细胞因子TNF-α的相对表达水平.通过HL-60细胞调理吞噬实验测定表位肽诱导产生抗体所介导的调理吞噬杀伤功能.免疫B细胞缺失小鼠,感染攻毒后检测肠组织C.jejuni的定植量.结果 PEB155-72aa、PEB197-114aa、PEB12u-228aa均能与PEB1抗血清产生强烈IgG抗体反应.抗PEB155-72aa、抗PEB197-114aa和PEB1211-228aa血清均能与重组的PEB1产生较强的抗原抗体反应.与CFA/IFA组相比,免疫PEB155-72aa、PEB197-114aa、PEB1211-228aa后血清中的抗体能够显著增强抗体介导的HL-60细胞的调理吞噬作用(P＜0.01),均显著降低C.jejuni在空肠组织中的定植量,同时也均显著降低炎性细胞因子TNF-α的相对表达水平(P＜0.01).PEB155-72aa-KLH+CFA/IFA组,PEB197-114aa-KLH+CFA/IFA组,PEB1211-228aa-KLH+CFA/IFA组中,免疫B cell Knock out(B细胞缺失)小鼠攻毒后,C.jejuni在空肠组织中的定植量均显著高于WT(野生型)小鼠的定植量(P＜0.01).结论 成功鉴定出3个具有良好免疫原性和免疫保护作用的优势B细胞抗原表位(PEB155-72aa、PEB197-114aa、PEB1211-228aa),可用于C.jejuni疫苗的后续开发研究.

树状串联hTERT表位肽负载mDC疫苗体外激发抗瘤免疫应答的效应研究

目的 通过树状串联hTERT表位肽的髓样树突状细胞(mDC)递呈,刺激同源淋巴细胞,探索一种更优的肿瘤免疫治疗方法.方法 人工固相合成4分支的树状串联hTERT表位肽(MAP)及其各分支单肽,免疫荧光检测hTERT的表达情况,免疫磁珠分选mDC,尼龙毛柱纯化T细胞,ELISA检测mDC的IL-12p70和淋巴细胞的(M)TNF-α、IFN-γ分泌量,流式细胞技术检测mDC、LC的相关表面分子以及效应性T细胞对HLA-A2型肿瘤A549、MDA-MB-231和SW480的杀伤率,并作统计学分析.结果 所有肿瘤细胞都表达hTERT,且胞核大于胞浆;MAP和混合单肽对3种肿瘤细胞都有杀伤效应,且MAP的杀伤效应大于混合单肽,有统计学差异.结论 人工合成hTERT的MAP肽通过mDC能足够强的激活同源淋巴细胞,在肿瘤疫苗的研发中有重要意义.