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加载白血病抗原肽PRl的HLA-A*0201四聚体制备
目的 制备加载白血病抗原肽PR1的HLA-A*0201四聚体.方法 构建HLA-A*0201-BSP和β2-微球蛋白(β2M)原核表达载体,进行目的蛋白表达、纯化.在体外将PR1(VLQELNVTV)与纯化的HLA-A*0201-BSP、β2M通过稀释复性折叠成HLA-A*0201-PR1复合物.利用BirA酶进行生物素标记.再经阴离子交换纯化得到生物素化的HIA-A*0201-PR1复合物单体.此单体与PE标记的链霉亲和素按4:1比例混合,即可形成四聚体.结果 成功制备了HLA-A*0201-PR1四聚体.结论 制备的HLA-A*0201-PR1四聚体为定量检测白血病患者体内PR1抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞提供了有力工具.
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MHC-表位肽四聚体技术在病毒性肝炎研究中的应用
可溶性MHC-肽四聚体是根据T细胞活化的双识别原理,用生物工程技术将MHC-Ⅰ类分子重链α与β2微球蛋白在体外组装,并结合抗原表位肽,形成一个能够与相应TCR特异性结合的单体,再将4个单体组装在一起,称为四聚体.四聚体用荧光染料标记,供流式细胞仪检测,就可以用于具有特定TCR的T细胞的研究.在病毒性肝炎的研究中,四聚体技术可以直接检测抗原特异性CTL数量,在感染急性期抗原特异性CTL比恢复期高,肝炎自愈者高于慢性感染,肝内高于外周血,但明显低于其他病毒性疾病.四聚体标记联合其他膜表面分子的标记(或细胞内细胞因子染色),可以评价抗原特异性CTL的功能状态,还可以联合一些特殊的荧光染料,评价抗原特异性CTL的分裂增生能力.
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慢性HBV感染肝炎突发患者外周血病毒抗原表位肽特异性CTL的数量研究
目的:了解慢性乙肝患者肝炎突发时抗原特异性CTL反应水平.方法:用四个HBV抗原表位肽四聚体(HBcAg18-27,HBsAg183-191,HBeAg335-343,多聚酶P的575-583)对外周血中抗原特异性CTL进行检测,分析健康献血员和慢性乙型肝炎患者病毒抗原表位肽特异性CTL的出现频率.结果:6例HLA-A2阳性献血员,6例HLA-A2阴性的HBV感染患者,抗原表位肽特异性四聚体阳性细胞占CD8细胞的高百分比为0.02%,以0.02%为四聚体检测域值.29例HLA-A2阳性慢性HBV感染患者,其中27例外周血四聚体细胞阳性,检出率93.1%.肝功能ALT在正常上限5-10倍者四聚体阳性细胞比例描写高于其他组(P＜0.05).结论:HLA-表位肽四聚体技术直接检测外周血中抗原特异性CTL具有特异性高,敏感性强的特点.大部分慢性HBV感染患者体内仍存在抗原特异性的CD8细胞,而且肝炎突发时抗原特异性细胞数量增加.
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肾移植受者外周血巨细胞病毒特异性CTL的比例及其意义探讨
目的 建立检测巨细胞病毒(CMV)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的新方法,探讨其在肾移植受者外周血的比例及其意义.方法 筛选2009年1月至2010年12月期间在解放军第三○九医院全军器官移植研究所接受初次肾移植受者共计30例入组,健康体检志愿者10名作为健康对照组.采用四聚体技术(tetramer technology),在流式细胞仪上直接检测各组的CMV抗原特异性CTL的表达比例.结果 移植组和健康对照组外周血CMV抗原特异性CTL(CMV-pp65特异性CD8+T细胞)的阳性率在0.16％ ～7.21％.移植患者根据是否发生CMV活动性感染,分为巨细胞病毒阳性组(CMV+组,n=15)和巨细胞病毒阴性组(CMV-组,n=15).CMV+组患者的CMV抗原特异性CTL的比例(2.95％ ±0.62％)显著高于CMV-组患者(1.17％±0.45％)和健康对照组(0.65％±0.17％),差异具有统计学意义(P=0.003、0.006).CMV+组患者在CMV抗原(CMV-pp65)阳性期,其CMV抗原特异性CTL的比例为(2.95％±0.62％),转阴后,比例明显下降至(1.50％±0.32％).CMV+组患者的CMV抗原特异性CTL比例与CMV-pp65阳性细胞数呈显著正相关(Pearson检验,r=0.871,P＜0.01).结论 肾移植受者外周血CMV特异性CTL比例对于判断CMV预后具有重要评价指导意义,为今后肾移植术后CMV感染靶向治疗提供依据.
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慢性乙型肝炎患者外周血抗原特异性CD8＋T细胞功能的初步分析
目的：评价慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血抗原特异性CD8＋T细胞的功能及与临床相关指标的关系。方法采用主要组织相容性复合物（MHC ）-抗原肽四聚体标记技术检测CHB患者外周血乙型肝炎病毒（HBV）抗原特异性CD8＋T细胞，并对其细胞因子分泌能力进行检测，分析其与临床生化和病毒学指标的关系。结果35例人类白细胞相关抗原（HLA）-A基因型为A02或A24的患者中有9例患者至少检出1种被四聚体识别的HBV抗原特异性CD8＋T细胞，其白细胞介素2（IL-2）和γ干扰素（IFN-γ）的分泌能力明显低于其自身的外周血总CD8＋T细胞。检出抗原特异性CD8＋T细胞患者的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平明显高于阴性患者，而HBV DNA水平低于阴性患者。结论 CHB患者外周血抗原特异性CD8＋T细胞存在明显的功能缺陷，可能因病毒抗原持续刺激造成功能耗竭，但外周血出现抗原特异性CD8＋T细胞仍表明患者体内出现较强抗病毒免疫反应。
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慢性乙型肝炎患者外周血 CD8＋T 淋巴细胞功能的变化
目的：探讨慢性乙型肝炎患者 CD8＋ T 淋巴细胞功能的变化。方法利用主要组织相容性复合物（MHC）-抗原肽四聚体标记技术检测 HBV 的特异性 CD8＋ T 淋巴细胞，并检测其细胞因子的分泌能力，分析其与病毒学指标及临床生化指标的关系。结果人类白细胞相关抗原（HLA）-A 基因型为 A02或 A24的42例患者中，有11例患者至少检出一种被四聚体识别的 HBV 特异性 CD8＋ T 淋巴细胞，白细胞介素2（IL-2）及γ（IFN-γ）干扰素的分泌能力相对于其自身的外周血总 CD8＋ T 淋巴细胞显著降低（t＝14．231、10．450，P ＜0．01）。检出抗原特异性 CD8＋ T 淋巴细胞的患者，其血清ALT 的水平较阴性患者高（t＝2．306，P ＜0．05），而 HBV DNA 水平却相对低（t＝－4．447，P ＜0．001）。结论慢性乙型肝炎患者外周血的抗原特异性 CD8＋ T 淋巴细胞的功能存在明显的缺陷，可能与病毒抗原的持续刺激导致功能耗竭有关。
关键词： 慢性乙型肝炎 CD8 + T 淋巴细胞 功能耗竭 四聚体技术 -
MHC四聚体技术的应用研究进展
通过描述免疫应答和免疫反应特征来定义抗原特异性T淋巴细胞反应类型的方法具有繁杂、准确性差等缺点.为精确辨别T淋巴细胞反应类型,发展了可直接对抗原特异性T淋巴细胞进行标记的MHC四聚体(tetramer)技术.利用T细胞受体(TCR)与MHC分子识别结合机制在T细胞表面结合肽-主要组织相容性复合物(peptide major histocompatibility complex,pMHC)配基,T细胞聚合形成可溶性肽-MHC四聚体,增加特异性T细胞检测的灵敏度,该技术即四聚体技术.该文主要论述MHC四聚体技术的原理和临床应用.
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健康青年人HCMV特异性CD8+T细胞频率和表型分析
目的 利用负载pp65495.503抗原肽的HLA-A*0201四聚体染色结合流式细胞术,分析HLA-A2+健康青年供者外周血中HCMV pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞的频率和表型.方法 以优化的四聚体染色方法对22例中国青年供者全血进行染色,用流式细胞仪对样品进行三色荧光分析.结果 健康中国青年人外周血中存在高频率的pp65495-503特异性CD8+T细胞,占CD8+T细胞的百分率为0.14～6.84%(均数2.45%);表型分析显示其CD28+细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为为32.5%(±21.7%)和58.58%(±10.4%)(P＜0.001);CD57+细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为55.8%(±18.4%)和27.4%(±8.3%)(P＜0.001).同时,对三例健康青年人CD8+T细胞上多种表面分子的详细分析显示,pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞有不同比率的细胞表达CD62L、CD45RO、CD38和CD27,而且还有一定比例的细胞表达CD45RA,但不表达活化抗原CD69分子.结论 青年中国人外周血中存在高频率的HCMV特异性CD8+T细胞,这些细胞的表型存在高度异质性,可能是处于不同分化阶段的记忆和效应细胞群体组成.
关键词： 四聚体技术 人巨细胞病毒 记忆型CD8+T细胞 流式细胞术
