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体外受精中3原核胚胎的发育及可利用价值的探讨
目的:探讨体外受精(IVF)中异常的3原核(PN)胚胎的发育及可利用价值.方法:收集IVF治疗周期中废弃的3PN受精卵204个进行体外培养,观察其发育能力,并与同周期的1 138个2PN受精卵进行比较;采用胚胎植入前遗传学筛查(PGS)技术对由3PN发育成的19枚囊胚进行非整倍体分析.结果:3PN组和2PN组的卵裂率无统计学差异(P＞0.05);但3PN组囊胚形成率显著低于2PN组[9.6％(19/97) vs 37.9％(204/342),P＜0.01].整倍体分析显示,10.5％(2/19)的3PN来源的囊胚为正常二倍体核型.结论:3PN受精卵有继续发育能力;囊胚培养和高通量测序可作为有效筛选异常PN受精卵中正常核型胚胎的一种方法.
关键词： 3原核(PN)胚胎 囊胚 体外培养 高通量测序(HTS) 整倍体分析 -
冷冻保存对人卵巢组织雌二醇分泌功能的影响
目的:探讨冷冻保存对人卵巢组织E2分泌功能的影响.方法:收集20例卵巢良性肿瘤手术患者的正常卵巢皮质,随机分为新鲜对照组和玻璃化冷冻组,冻融后行体外培养,比较冻融前、后人卵巢组织的内分泌功能. 结果:①在体外培养期间,所有卵巢组织均能持续分泌E2.新鲜对照组E2分泌水平始终高于冷冻组,培养前10 d,差异有统计学意义(P<0.05);培养12 d之后,组间E2水平无统计学差异(P>0.05).②体外培养初期E2分泌水平较平稳,随培养时间延长E2水平呈波动性变化.结论:人卵巢组织冷冻解冻后仍具有内分泌功能,随着培养时间的延长,新鲜组与冷冻组间E2分泌水平可能无差异.
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小鼠体外培养囊胚辅助孵化的初步研究
目的:探索体外培养和辅助孵化技术对体外发育小鼠囊胚孵出率的影响.方法:将昆明白种小鼠的2～4-细胞胚于体外培养到囊胚,观察比较:(1)体外培养囊胚与体内发育囊胚的自然孵化率;(2)体外培养囊胚经辅助孵化后与未行辅助孵化(对照组)的体外孵化率.结果:(1)体外培养囊胚与体内发育囊胚的自然孵化率分别为75.4%和96.2%;有显著差异(P<0.001).(2)辅助孵化与对照组的体外孵化率分别为97.7%和74.0%,有明显差异(尸<0.05).结论:体外培养对囊胚的孵化有不利影响;辅助孵化则能明显提高体外培养囊胚的孵出效率.
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小鼠及人胚胎分割技术的研究
植入前小鼠胚胎(preimplantation embryo)的透明带经软化后,用固定在显微操作臂上的微玻璃针行胚胎分割,2-、4-、8-细胞胚胎及桑椹胚分割成功率分别为90.6%、85.0%、73.6%、71.4%.所获半胚体外培养后,胚泡发育率分别为62.1%、80.1%、83.0%、89.2%.随胚胎细胞数目增多,分割成功率降低,而发育率则提高.将8-细胞胚组及桑椹胚组的半胚移植到假孕母鼠后,幼仔出生率分别为14.6%、15.1%.同法分割4-细胞人胚胎2个,获半胚4个,分割成功率为100%.
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卵巢低反应患者MI期卵母细胞体外自发成熟后行ICSI妊娠分娩1例
在体外受精(IVF)控制性超促排卵(COH)助孕治疗中,卵巢低反应的发生率为9%～24%,此类患者常因获卵少、无可利用胚胎而取消移植.为了进一步提高卵子利用率,本文探讨在行ICSI治疗的患者中,已经剥除颗粒细胞的未成熟卵是否具有延长培养,继续利用的价值.
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冻存复苏人卵巢皮质在裸鼠体内的发育及卵细胞的提取
探求冻存复苏人卵巢皮质在裸鼠体内的发育及卵细胞的提取.方法:取手术切除的5例患者卵巢皮质,放入1.5mol/L的二甲基亚砜+10%血清中,应用可控程序冷冻仪逐渐降温,移入液氮中冻存.三个月后,将融解的卵巢皮质移植入89只裸鼠皮下,注射hFSH12周,刺激卵泡生长.注射hCG36h后,用18号针头穿刺提取卵细胞.结果:卵泡直径为3～9mm,穿刺获19个卵细胞,放入TC-199培养基,加20%胎牛血清,25mmol/L丙酮酸,75mIU/mL FSH和LH培养,获15个分裂中期的次级卵母细胞.结论:人卵巢组织冻融后可异体移植生长,且其卵细胞可在体外发育成熟.
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大鼠睾丸Sertoli细胞的分离和培养
Serto1i细胞(支持细胞)是睾丸的主要基质细胞,对生精细胞的分化成熟提供微环境,其所分泌的多种物质对其周围及自身均有影响[1,2].为了研究Seno1i细胞,须将其从睾丸组织中与其它细胞分离,并在体外培养.
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卵巢组织体外培养及冻融技术的研究进展
癌症患者治疗前行卵巢组织冷冻保存、待其病情稳定后,重新进行卵巢组织移植,可使其保持女性的正常生殖内分泌功能,并能够进行正常生育.目前常用的冷冻方案包括慢速程序化冷冻和玻璃化冷冻,其中慢速程序化冷冻是卵巢组织冷冻的标准方法,但近年来玻璃化冷冻由于其方便、高效,越来越受到关注.卵巢组织冷冻保存作为癌症患者保留生育能力的一种选择具有广泛的应用前景.虽然卵巢组织移植已用于临床,并有成功分娩的报道,但卵巢组织体外培养技术尚处于研究阶段,仍不够成熟.本文旨在对卵巢组织体外培养及冻融技术的方法改进以及现阶段的研究情况作一综述.
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脂多糖体外刺激对小鼠B10细胞的影响
目的:探索脂多糖(LPS)体外刺激对小鼠B10细胞的影响.方法:在LPS刺激下,体外培养小鼠脾脏和腹腔细胞5h或48h,流式细胞仪分析CDI9+IL-10+B细胞比例.结果:PIM刺激5h,小鼠脾脏和腹腔CD19+IL-10+B细胞比例分别升高至1.22％和14.82％(P＜ 0.01),在PIM刺激的基础上加入LPS,小鼠脾脏和腹腔中CD19+IL-10+B细胞比例分别升高至平均2.35％和26.58％(P＜0.01).LPS刺激48h可进一步升高CD19+IL-10+B细胞比例,脾脏和腹腔分别为6.42％和38.38％,明显高于PIM48 h刺激组(P＜0.01)和L+PIM5 h刺激组(P＜0.05),但LPS刺激48 h不改变CD5、CDId的表达水平.结论:体外刺激5h时,L+PIM刺激可促进小鼠B10细胞活化;刺激48 h时,LPS可进一步促进B10细胞IL-10的表达,这一作用可能是通过诱导B10前体细胞成熟实现的.
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成体干细胞在神经组织工程中的研究及应用
组织工程学的基本原理是应用细胞生物学和工程学的原理,将体外培养扩增后具有生物学活力及特定功能的细胞与支架材料复合,用以修复或改善损伤组织或器官的结构与功能,终形成有活力的正常组织或器官,达到真正意义上的生物学重建[1].干细胞是机体存在的一类特殊细胞,他们的显著的生物学特性是既有自我更新的能力又具有多向分化的潜能,在适当条件下可被诱导分化为不同的细胞和组织.干细胞按其发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类.虽然胚胎干细胞更具有全能性,理论上可生成任何组织,但胚胎干细胞诱导分化的细胞和组织若用于病人的细胞和组织替代性治疗,相当于异体移植,存在免疫排斥的问题,而且胚胎干细胞能否分化为肿瘤样的组织,尚是个未知数[2].而成体干细胞来源广泛,而且不涉及伦理问题,成体干细胞与胚胎干细胞相比更具有优势.本文结合近年来国内外对成体干细胞即骨髓间充质干细胞、神经干细胞等在神经组织工程中的研究,着重对研究的现状及面临的问题和未来发展趋势进行综述.
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骨髓经羟乙基淀粉(HES)处理后分离和培养MSCs的初步探讨
种子细胞、支架材料和生长因子是组织工程的三大要素,而寻找合适的种子细胞是成功的重要因素[1].骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs),因其具有多向分化潜能,如形成骨、软骨、肌组织、皮肤等,成为具代表性的种子细胞[2,3].目前,国内外已分离培养出人,小鼠,大鼠,兔等的骨髓MSCs,并诱导分化出多种组织[4],但由于它在骨髓内含量极少,只占0.01%～0.001%,而组织工程需要短期内有大量的种子细胞再生组织,故需进行体外培养、分化和扩增[5].本实验对骨髓MSCs的两种分离方法进行比较,以期获得更好的方法.
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野生刺五加内生真菌分离与鉴定
刺五加为中医临床常用中药，含有多种有效成分，药用价值极高。现阶段，国内外对刺五加的研究不断深入，但是多以外在环境对植物体药用成分的影响为主，忽略了内环境的影响。研究与实践证实［1］，体外培养刺五加的药用成分与效果远低于野生刺五加，并且成分相对不稳定。内生真菌会利用自身活动、代谢产物，对宿主次级代谢产生一定程度的影响［2］。我们对野生刺五加内生真菌分离与鉴定进行分析探讨，报道如下。
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软骨仿生环境下的培养在软骨组织工程中的研究进展
关节软骨为透明软骨,富有弹性,摩擦因数小,能吸收关节间振荡,是维持关节功能的重要结构,临床上因多种原因导致的关节软骨缺损的发病率很高,由于关节软骨中无神经、血管,自愈能力较差,因此,关节软骨自身修复能力有限,即使是小的关节软骨损伤也可能导致关节软骨退行性病变[1].目前的治疗方法如软骨移植、微骨折等已经被广泛的应用于关节软骨的损伤修复[2],但是,研究结果显示,这些方法都存在一些技术上的局限性,均不能实现长期的软骨修复.
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可卡因对小鼠离体脾细胞功能的影响
目的 观察盐酸可卡因对小鼠体外培养脾细胞功能的影响.方法 采用小鼠脾细胞体外培养的方法,在细胞培养液中加入终质量浓度分别为10、20和100μg/mL的盐酸可卡因,连续培养.检测脾细胞的ConA增殖反应、IL-2、IFN-γ的活性.结果 实验组ConA诱导的小鼠脾细胞增殖反应明显降低,IL-2和IFN-γ的活性显著下降,与对照组相比较有显著性差异(P＜0.05;P ＜0.01).结论 可卡因对体外培养脾细胞功能有显著的抑制作用.
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MTT法测定化疗药物及郑氏植物蛋白对肿瘤原代细胞体外增殖的影响
目的与方法:为了给临床提供肿瘤标本细胞的生长信息并筛选敏感性抗癌药,提高疗效,本文以MTT比色法对100例实体瘤原代细胞进行了8种化疗药物及郑氏植物蛋白对其体外增殖影响作用的测定.结果与结论:结果表明8种临床常用的化疗药物中以顺铂、卡铂、5-氟脲嘧啶、丝裂霉素C的抑瘤敏感性较高,但不同标本瘤细胞的敏感性药谱不一样,提示了肿瘤治疗个体化的必要性.同时显示郑氏植物蛋白对70%的标本瘤细胞有促进增殖的作用.长春新碱、阿霉素和足叶乙甙对个别标本瘤细胞也有促增殖作用.
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小鼠腔前卵泡体外培养成熟-染色体分析技术的建立
背景与目的:初级卵母细胞生长过程中对理化因子反应敏感,拟建立小鼠腔前卵泡体外培养成熟(IVG)-染色体分析技术,为生殖毒理学提供有效的检测模型.材料与方法:采用机械分离法从12～14日龄昆明小鼠的卵巢中分离出直径为140～160 μm的腔前卵泡,单个卵泡放入微液滴培养体系中,隔天半量换液,连续培养10 d,对成活卵泡体外诱导超排,于16～24 h后,检测卵母细胞成熟情况,分别计数停滞在生发泡期(GV)、生发泡期破裂(GVBD)和排出第一极体(PB)的卵母细胞数,对卵母细胞进行染色体数目与结构分析,并与体内发育体外成熟卵母细胞(IVM)及体内超排成熟卵母细胞(IVC)进行比较分析. 结果:从4只小鼠卵巢中分离得到332个腔前卵泡,培养早期卵泡直径增长显著,随后呈"摊鸡蛋"样生长,部分形成假腔.培养10 d后存活率为95.78%(318/332).激素诱导排卵后,卵丘.卵母细胞复合体排出率72.01%(229/318),其中11.80%(27/229)停滞在GV期,39.30%(90/229)发生GVBD,47.16%(108/229)发育成熟,排出第一极体(PB),1.74%(4/229)发生孤雌活化.IVG与IVM、IVC两种方法获得的卵母细胞染色体对比分析,未见明显的染色体数目与结构异常. 结论:小鼠腔前卵泡体外培养成熟,可获得与体内生长相同的成熟卵母细胞,染色体分析未见异常,可成为一种良好的生殖毒理学体外检测与卵泡发育机制研究模型.
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体外培养中胚胎发育潜能的评价
自1978年世界上首例采用体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)技术的婴儿诞生的30年以来,一系列辅助生殖技术蓬勃发展,并在全世界范围内广泛开展.IVF-ET已经成为治疗不孕症为有效的方法之一.尽管技术不断完善,出生婴儿数目逐年上升,但辅助生殖技术的发展仍面临着一系列困难,包括IVF-ET过程的关键技术——卵母细胞与胚胎的体外培养.通常患者每个周期促排卵治疗后会获得10个左右的受精卵.
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神经干细胞体外培养方法及影响因素研究进展
神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群.神经干细胞的发现对患有神经系统难治性疾病患者的治疗带来了福音,但体内内源性神经干细胞的数量极少,限制了其在治疗疾病中的应用,所以如何有效提高神经干细胞培养存活率、克隆形成率将是其在临床应用的重要基础和前提.本文就目前对神经干细胞体外培养方法及影响因素的研究进展做如下综述.
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骨髓间充质干细胞的体外表达与表面特性标志的实验研究
目的:建立一种骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)体外培养方法,研究其表面特征性标志(表面分子).方法:用含10%小牛血清的低糖DMEM培养液,把细胞的接种浓度分成A组小于1×104g/ml与B组大于5×106g/ml两组进行体外培养,扩增.倒置显微镜观察其形态、增殖能力,流式细胞仪检测细胞的表面分子表达情况.结果:A组细胞生长缓慢,但形态、增殖能力及表面特征性标志与B组相同.MSCs同时表达CDw90、CDw44、CD29及CD1a.结论:该方法可作为体外培养MSCs的一种方法,经济实用.MSCs不仅表达CDw90、、CD44、CD29而且表达CD1a.
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鼠脂肪干细胞体外培养及软骨分化的研究
目的 分析鼠脂肪干细胞体外培养及软骨分化情况.方法 取雄性小鼠腹股沟脂肪组织,消化分离脂肪组织获取纯净脂肪干细胞,观察脂肪干细胞体外培养形态,绘制生长曲线,并诱导软骨细胞分化.结果 鼠脂肪干细胞呈梭形或多角形生长与骨髓基质干细胞成长特点相似;鼠脂肪干细胞成长曲线呈S型;软骨分化后呈圆形,形成软骨结节;软骨细胞诱导后组织细胞呈多角形且边界清晰,甲苯胺蓝染色显阳性.结论 提取鼠脂肪细胞分离培养后可获取具有分化潜能的干细胞,且于体外繁衍后代,可为软组织工程提供种子细胞.
