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血友病A患者凝血因子Ⅷ基因内含子1倒位的检测
目的 检测中国血友病A(HA)患者中凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子1倒位(inv1)的发生频率,并和国外相关资料相比较,明确部分中国HA患者的发病机制.方法 用一期法检测158例无关家系HA患者的FⅧ活性(FⅧ:C),进行HA表型诊断;分别采用长距离和双管多重PCR技术检测内含子22倒位(inv22)和invl;直接测序法进行FⅧ基因全长序列分析.结果 在158例无关家系的HA患者中发现有2例(家系)invl阳性,检出率为1.26%;对其中1例阳性患者家系进行调查,发现1例罕见女性HA患者为invl携带者.对女性患者另一条染色体FⅧ基因进行全长测序,未发现有新基因突变.结论 invl在中国HA人群中发生率相对较低.女性HA患者为inv1杂合子,其发病考虑为与X染色体非随机失活有关.
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由ALK1基因内含子突变引起的遗传性出血性毛细血管扩张症
目的 探讨遗传性出血性毛细血管扩张症发病的分子机制.方法 (1)用聚合酶链式反应-单链构像多态性分析(PCR-SSCP)寻找异常突变的外显子及其相邻剪接位点.(2)通过DNA测序确定突变的类型.(3)使用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法确定剪接方式.结果 用PCR-SSCP方法发现扩增ALK1基因第4外显子及相邻的部分内含子片段有突变位点.对有突变该片段,用DNA测序检测,发现第4外显子的给位剪接点相邻碱基A>T(Ⅳ S4+3 a>t)的突变,并用反向测序确认.用RT-PCR方法检测ALK1基因表达mRNA情况,电泳和测序发现第4外显子的丢失.结论 ALK1基因的Ⅳ S4+3 a>t突变,导致ALK1基因表达异常,形成无功能截短蛋白,引起HHT2.
关键词: 遗传性出血性毛细血管扩张症 基因 内含子 突变 -
广东省汉族人群肠易激综合征5-羟色胺转运蛋白基因多态性研究
肠易激综合征(IBS) 是以腹痛/ 腹部不适伴排便习惯改变为特征的功能性肠病.该病发病率高,我国北京和广州两地报道分别为0.82%和5.67%[1].其发病机制尚不完全清楚.研究表明5-羟色胺(5-HT)、遗传因素可能与IBS的发病有关[2].人类5-羟色胺转运蛋白(SERT)基因存在多个多态性位点,国外研究显示启动子区的5-HTTLPR和第2内含子区的可变数目串联重复(VNTR)多态性与IBS有关[3-5].国内相关的报道较少,为此我们对IBS患者和健康人的SERT基因多态性进行对照研究.
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胃蛋白酶原C基因多态与胃癌遗传易感性的相关性研究
为了探讨遗传因素与胃癌的关系,我们选择胃蛋白酶原C(pepsinogen C,PGC)基因作为研究的标志基因。有研究发现,在PGC基因的7~8内含子内存在100 bp的插入-缺失RFLP片段,并在7~8内含子内存在4种分子量不同的多态片段[1]。在以前的研究中[2],我们也发现PGC基因多态与胃癌发生之间存在某种联系。在本研究中我们通过聚合酶链反应(PCR)方法,检测了PGC基因的多态,并进一步分析PGC基因多态与胃癌发生之间的关系。
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白细胞介素-6与纤维化疾病
白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)是相对分子质量19 000~28 000的糖蛋白,可由T细胞、B细胞、单核细胞和非淋巴细胞产生.其基因位于第7号染色体,全长5 kb,含有4个内含子及5个外显子,通过对其编码区及上、下游序列的研究,发现该基因多态性主要存在启动子区的-597G/A、-572C/G、-174 G/C、-373AnTn[1].其基因表达的变化与某些疾病的病理生理变化密切相关.
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刺五加GAPDH基因组DNA的克隆与分析
目的 克隆刺五加GAPDH基因的DNA及启动子序列,并进行生物信息学分析.方法 以刺五加的基因组DNA为模板,采用PCR和TAIL-PCR技术克隆GAPDH基因的全长DNA序列及5'端上游启动子序列,并对其进行生物信息学分析.结果 克隆到长4 103 bp的刺五加GAPDH基因全长DNA及启动子序列.该基因共包含12个外显子和11个内含子,其剪切均符合GT-AG原则.刺五加GAPDH的启动子片段长1 304 bp,转录起始位点A位于起始密码子ATG上游61 bp处.启动子除含有TATA-box、CAAT-box等基本元件外,还有诸多与激素应答、光响应和胁迫信号等有关的顺式作用调控元件.结论 首次克隆到刺五加GAPDH基因的全长DNA及启动子序列,为深入研究GAPDH基因结构特征与功能奠定基础.
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为建立转基因猪进行异种器官移植构建CD59表达载体用ICAM-2启动子及CD59第一个内含子的分子克隆
目的:为建立能更有效抑制HAR的转人CRP基因猪,克隆其调控序列-ICAM-2启动子、Intronl增强子,使之能够在血管内皮细胞上大量表达.方法:提取人基因组DNA.用PCR方法克隆ICAM-2启动子、CD59的第一内含子片段.结果:电泳、测序鉴定,所获得片段与设计的一致.
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中国汉族人凝血因子Ⅶ基因中三个多态位点的研究
近年来,凝血因子在动脉血栓形成中的地位倍受关注.研究表明,凝血因子Ⅶ(FⅦ)是动脉血栓形成的危险因子[1].遗传因素与环境因素对FⅦ有很大影响,遗传因素主要是FⅦ基因内的几个多态位点:FⅦ基因启动子区域0或10 bp的插入(5′F7)、内含子7中的可变数目串联重复序列(IVS7)及FⅦ蛋白催化区域353位谷氨酰胺代替精氨酸(R353Q).目前尚未见到中国人FⅦ基因内各个多态位点等位基因频率及基因型频率的系统报道,我们用PCR技术结合酶切方法进行了这方面的研究.
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vWF胶原结合试验临床应用
血管性血友病(vWD)是一种常见的遗传性出血性疾病,是由于血浆中vWF质量或数量改变所致.vWD具有高度的异质性,不同型别的vWD发病机制和治疗方案不尽相同,因此,使用有效的试验方法对其进行分型很重要.我们应用ELISA法进行vWF胶原结合试验(简称vWF∶CBA),以了解vWF的功能,探讨其在vWD的诊断及分型中应用的临床意义.同时采用PCR技术检测vWF基因第40位内含子中2个四核苷酸短串联重复(STR)位点,分析1例1型vWD患者家系致病基因的连锁与传递关系,进一步证实vWF∶CBA对vWD诊断与分型的意义.
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PAI-1启动子区4G/5G基因多态性对血浆PAI-1水平影响
纤溶酶原活化剂抑制物-1(Plasminogen activitor inhibitor-1,PAI-1)是丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)家族成员之一,是纤溶系统的主要抑制物,可迅速、有效地抑制u-PA, t-PA的活性.血浆PAI-1水平变化是决定血浆纤溶活性的重要因素,是血栓性疾病的一个危险因子.PAI-1基因全长12.3 kb,包含9个外显子,8 个内含子.PAI-1基因的表达受多种因素调节,大量临床研究发现,PAI-1基因的启动子区4G/5G单核苷酸多态性与心肌梗死,脑梗死,深部静脉血栓等血栓性疾病有相关性.
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舌鳞状细胞癌p53基因突变的研究
现已发现,p53基因的突变是人类肿瘤发生发展过程中常见的基因事件,与口腔癌发生发展的关系密切.本研究采用单链构象多态性分析(PCR-SSCP)技术,对35例舌鳞癌组织及20例正常舌粘膜的p53基因第7,8外显子和第7内含子突变进行检测,并分析它与舌鳞癌的发生发展,包括临床分期、细胞分化程度、淋巴结转移的关系,探讨上述检测指标作为指导舌癌治疗及判断预后手段的可能性.
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新的含有11q13.5 HERV-Wgag序列的内含子转录子的鉴定
目的:鉴定位于染色体11q13.5的含有HERV-W gag序列的内含子转录子,探讨这一新的转录子对宿主基因PTD015选择性剪切的调控作用.方法:采用半巢式PCR和降落PCR扩增目的片段,克隆、测序、构建载体、转染JEG3细胞,采用实时PCR检测PTD015选择性剪切mRNA的水平.结果:鉴定了一个位于基因PTD015第二内含子上长1 739 bp的转录子,该转录子包含755 bp 11q13.5 HERV-W gag序列、527 bp 5′长末端重复序列和11q13.5 HERV-W 5′端457 bp片段.此内含子反义转录子质粒的转染使JEG3细胞PTD015选择性剪切mRNA的水平明显降低. 结论:源于基因PTD015第二内含子含有HERV-W gag序列的反义转录子可调节宿主基因PTD015的选择性剪切.
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p53基因内含子与肺癌
内含子是确保基因mRNA正常转录的必需结构,并且影响基因的表达.部分基因的内含子具有核酶作用,能降解特定的mRNA.内含子碱基在数量上占据基因DNA结构的绝大多数,许多酶切位点位于内含子上,通过核酶内切酶的作用使DNA降解是细胞凋亡的重要机制,而肿瘤是一种与细胞凋亡密切相关的疾病.通过这些机制,p53基因内含子的结构变化与肺癌的发生、发展有关.
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Fas凋亡途径与肿瘤的免疫逃避
肿瘤的发生是多因数、多阶段的过程,其机制非常复杂.细胞死亡过程的紊乱已被证明与肿瘤的形成密切相关.近几年来,Fas/FasL系统介导细胞凋亡与肿瘤免疫逃避的研究取得了很大的研究进展.提出了Fas/FasL系统介导细胞凋亡障碍是肿瘤形成的重要原因.本文将就Fas系统与肿瘤的免疫逃避的研究进展作一简要综述.1 Fas-FasL与细胞凋亡 Fas、FasL是介导细胞凋亡的一对蛋白质.Fas蛋白属TNFR/NGFR超家属成员,是I型跨膜受体蛋白.人Fas基因定位于第10号染色体q24.1区,有8个内含子和9个外显子.人Fas有两种形式:膜结合型和可溶型,其区别在于有无跨膜区.可溶的sFas是由于交替拼接转录翻译所致.目前发现Fas有4个重要区域与死亡信号传导有关:胞外区2个,与FasL特异性结合的死亡信号激发域和抗Fas单克隆抗体作用域;胞浆区含有一个由70个aa组成的:"死亡域”(DD)和一个由15个aa组成的C-端"拯救域”(SD).FasL为Ⅱ型跨膜蛋白,属于TNF超家族.人FasL基因定位于1号染色体(1q23),有4个外显子3个内含子.FasL主要表达于激活T淋巴细胞、激活的B细胞、自然杀伤细胞和免疫赦免部位(如睾丸的基质细胞、角膜、虹膜、视网膜上皮细胞、神经元细胞、甲状腺细胞、唾液腺腺泡细胞)以及肿瘤细胞. 近几年来,Fas介导凋亡信号传导机制的研究取得了很大的进展,发现能降解多种蛋白质的羊胱天冬酶(Caspase)家族起着关键作用[1].现已发现13种Caspase,分为启动型和效应型二类:启动型Caspase接受死亡信号,启动调亡或激活下游分子;而效应型Caspase则降解细胞骨架、蛋白质、核酸.前者包括Caspase-8,9,10,后者包括Caspase-3,6,7.Caspase都是以酶原(procaspase)形式存在.Caspase具有自催化活性,并可催化其他procaspase的激活,从而构成了Caspase级联活化系统.胞浆内存在着介导膜Fas与Caspase的多种御接蛋白,如Fas相关死亡区蛋白(FADD)、丝氨酸激酶RIP等.御接蛋白的C-端有DD,N-端有死亡效应域(DED).FasL与Fas结合后,Fas通过C-端DD的相互作用,三聚化并使多个御接蛋白聚集到Fas上,形成诱导死亡信号复合体(DISC).细胞内的IL-1β转换酶样蛋白酶(FLICE,Caspase-8),其N-端含有两个与FADD中DED相似的串联区段,而C-端含有与Caspase相似的260个氨基酸的区段.通过DED的相互作用,FLICE与御接蛋白结合被征募到DISC.结合在DISC上的FLICE寡聚化并发生相互剪切自我活化形成Caspase-8.Caspase-8释放到胞浆中激活效应型Caspase-3,6,7,导致细胞凋亡.近研究发现,Caspase-8可把bcl-2家族的Bid切割成tBid,tBid能促进线粒体释放细胞色素c.释放到胞浆的cytc激活caspase-9,caspase-9再激活效应caspase,导致细胞凋亡[2].Yang等[3]发现了一种新的御接蛋白-Daxx,提出了Fas介导调亡信号传递的另一通路.Daxx与Fas的DD结合后,能激活JNK,引起caspase活化、细胞凋亡.FasL和Fas结合后,可激活膜鞘磷脂酶(Smase),降解鞘磷脂(sphingomyelin)产生可溶性的神经酰胺(ceramide),再激活caspase,诱导细胞凋亡[4].
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凋亡抑制蛋白Survivin在恶性肿瘤中的表达及其临床诊断意义(上)
Survivin又称存活素,是新近发现的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的一个成员,是一种癌基因,是迄今发现强的凋亡抑制因子,也是目前分子量小的IAP蛋白(分子量为16.5kD).1997年,Altier利用效应细胞蛋白酶受体I(EPR)cDNA在人类基因组库中筛选克隆出Survivin基因,该基因全长1.6kD,位于17q25区,有4个外显子和3个内含子.
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白细胞介素-13与肾脏疾病
白细胞介素-13(IL-13)是一种主要由活化的Th2细胞分泌的抗炎性细胞因子,具有免疫抑制及免疫调节作用.其初被命名为p600蛋白,1993年Keystone细胞因子会议上被正式命名为IL-13.人IL-13基因约为4.5 kb,定位于人第5号染色体(5q23-31),包括4个外显子和3个内含子[1].
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抗早发性无义突变疾病药物研究进展
随着后基因组时代的到来,基因芯片和大规模测序技术的日趋完善,各种遗传疾病的病因学原理逐步被人们所了解,个性化治疗也渐渐进入了人们视野.由于遗传、基因突变(无义突变、移码突变、内含子错误剪切)或者后天性获得的原因,在基因组中正常终止密码子的上游,形成了一个提前的终止密码子,称为早发性无义突变(premature stop codon,PTC).在下游的蛋白质翻译过程中,肽链合成在早发性无义突变处提前终止,肽链的大量缺失或者产生没有功能的截短型蛋白质,导致疾病的发生.经人类基因组突变数据库(Human Genome Mutation Database,HGMD Professional re-lease,http://www.hgmd.org)2012年的权威统计,无义突变(nonsense mutation)是多种遗传疾病的病因,其中大约11.2%是由于早发性无义突变引发的.另外,很多肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)由于早发性无义突变的存在,使得细胞凋亡途径改变,产生肿瘤[1].
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人类白细胞抗原-B27检测的方法学评析与选择
人类白细胞抗原-B27(HLA-B27)是人类主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类分子B位点的等位基因,位于人的第6号染色体短臂上,是由8个外显子和7个内含子组成[1].HLA-B27分子含有2条多肽链,一条是α链或重链,另一条是β链或轻链,相对分子质量约56 000.1968年由Thorsb等[2]发现,1973年Brewerton等[3]研究发现HLA-B27与多种脊柱关节病有关,尤其与强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)高度相关.近年来,还发现HLA-B27与机体的炎性改变和部分感染性疾病也呈不同程度的相关[4].临床上已将HLA-B27的检测作为某些疾病的一个重要诊断指标,因此,选择和使用一种简捷、特异、准确的检测方法则显得尤为重要.现对目前工作中应用的方法作一简述和评析,以供选择和参考.
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哺乳类心脏肌浆球蛋白重链基因中的富嘧啶基内含子的唯一保守性
研究了人类和大鼠的心脏α和β-肌球蛋白重链基因 中的嘧啶基比例。编码MyH C尾的外显子均是缺少嘧啶基的。这一特殊发现,即某些内含子是富嘧啶基的,而此种富嘧 啶基状态在人类和大鼠均有保留,使所有四种等位基因共有两个富含嘧啶基的内因子,并且 每对标准基因均含有两种不同的富含嘧啶基内因子。此种强烈保守性与这些内含子的序列无 关。基于基因组序列的对比研究所得到的上述发现提示基因组序列除了编码心脏肌球蛋白重 链多肽的作用以外,还具有其他附加的功能。
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线粒体DNA在检测线粒体功能障碍中的应用
人类基因组包括线粒体基因和核基因,线粒体基因是位于核外的独立双链DNA。由于线粒体DNA没有内含子,全部都是外显子,因此线粒体DNA的任何改变都会导致其基因序列发生改变,进而导致其编码的蛋白质发生改变,引起呼吸链功能的变化和能量代谢的缺陷,从而引发一系列疾病。近年来,随着对线粒体研究的增多,很多与线粒体功能障碍有关的疾病相继被报道。在PubMed、NCBI中关于线粒体功能障碍与疾病的文献引用已超过10000条。线粒体DNA作为线粒体功能障碍的一种非侵入性检测指标已在各个领域得到了应用。