Anti-CD28协同刺激增强anti-CD3体外激活T细胞并降低TGF-β的表达

T淋巴细胞在人体免疫系统中扮演重要的角色,其在体内处于抑制或耐受状态会导致免疫力下降,从而引起感染与肿瘤等发生.等近年来人们一直探讨体外诱导活化T淋巴细胞用于过继免疫治疗.目前国内外多用抗-CD3体外激活T细胞,将CD8+CD25+杀伤性T细胞回输治疗免疫力下降引起的感染与肿瘤[1].抗-CD3刺激T淋巴细胞后,会介导T细胞分泌TGF-β.本研究在抗-CD3体外模拟T细胞活化的第一信号的同时,利用抗-CD28模拟第二信号协同激活T淋巴细胞,增强了CD3抗体体外活化T细胞的功能;同时,研究发现,在抗-CD28协同刺激下,TGF-β的表达水平出现明显下降;为进一步的临床应用提供依据.

淤胆血清及肝细胞生长因子体外诱导BMSCs向肝细胞分化

目的 探讨大鼠血清体外扩增BMSCs的可能性,及淤胆大鼠血清和肝细胞生长因子(hepatocytegrowth factor,HGF)体外诱导其分化为肝细胞,解决肝组织工程细胞来源短缺的可行性. 方法 取6周龄健康雌性Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓细胞,分离、纯化并传代培养BMSCs.取12～14周龄健康Wistar大鼠40只,随机分为两组(n=20),制备正常及淤胆大鼠血清.取第3代BMSCs按培养液不同分组:A组,DMEM加10%FBS;B组,肝细胞生长培养基(hepatocyte growth medium,HGM)加5%FBS:C组,HGM加5%正常大鼠血清;D组,HGM加5%淤胆大鼠血清;E组,HGM加5%淤胆大鼠血清、25μg/L HGF.观察各组诱导培养过程中的细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,免疫细胞化学法检测甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)表达,高碘酸-希夫染色检测糖原表达,脲酶-谷氨酰脱氢酶法检测上清液尿素含量. 结果 诱导培养过程中D、E组出现多角形及双核细胞,A、B、C组细胞形态无明显变化.MTT生长曲线显示C组细胞生长速度快,B组慢,与A、D、E组比较差异均有统计学意义(P<0.05),A、D、E组间比较差异无统计学意义(P0.05).D、E组于诱导培养7 d开始出现AFP及CK18阳性表达,14 d开始出现糖原阳性表达,同时间点E组阳性表达率高于D组(P<0.05);D、E组上清液中尿素含量随诱导时间延长逐渐升高,同时间点E组高于D组(P<0.05).各时间点A、B、C组均未见AFP、CK18、糖原阳性表达,尿素浓度无明显变化. 结论 正常大鼠血清能明显促进BMSCs增殖;淤胆大鼠血清对BMSCs有一定促增殖作用,且能有效诱导其向肝细胞分化;联合使用淤胆血清和HGF能提高细胞分化率.

CD34+细胞体外诱导的肝样细胞在小鼠体内修复受损肝组织的研究

目的 研究CD34+细胞体外诱导的肝样细胞在小鼠体内修复受损肝组织的作用. 方法 采用密度梯度离心法分离脐血中的单个核细胞并获得富集CD34+细胞,调整细胞密度为1×105个/mL,使用含干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、EGF、抑瘤素M(oneostatin M,OSM)和bFGF 的无血清培养基(5种细胞因子浓度分别为50、20、20、10、10 ng/mL)体外诱导10 d.取6周龄雌性ICR小鼠48只,以二乙酰氟氨和CCl4注射制备肝损伤模型.将小鼠随机分为实验组和对照组(n=24),实验组将诱导后细胞(1.6×105个/只,含CD34+细胞1×104个)通过尾静脉注射入肝损伤小鼠体内,对照组注射等量无血清培养基,术后7、14、21、28 d两组分别处死6只小鼠,行HE染色、PCR凝胶电泳、免疫组织化学染色及肝功能检测. 结果 HE染色显示,对照组术后28d时肝组织形态恢复正常,实验组术后14 d时即已恢复正常.PCR凝胶电泳和免疫组织化学染色结果显示,实验组术后各个时间点在肝组织中均可检测到表达人血清白蛋白的细胞,而对照组术后28 d内均未检测到.肝功能检测结果显示,对照组术后14 d时谷丙转氨酶活性恢复正常,实验组小鼠术后7 d时即已恢复正常;但两组谷草转氨酶活性在28 d内均未恢复. 结论 CD34+细胞经体外向肝细胞方向诱导分化后,能在肝损伤的小鼠体内促进受损肝组织形态和功能的恢复,并能在小鼠受损肝脏中转化为人源肝细胞.

体外诱导多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌的适合度代价相关研究

目的 研究体外诱导多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌的适合度代价,并分析耐药株的分子特性.方法 采用体外诱导方法将临床分离的3株多黏菌素敏感肺炎克雷伯菌诱导成多黏菌素耐药株;微量肉汤稀释法检测体外诱导耐药前后菌株对临床常用抗菌药物的低抑菌浓度(minimal inhibititory concentration,MIC);采用PCR方法检测多黏菌素耐药相关基因pmrA、pmrB、mgrB、phoP和hoQ,并对阳性片段进行测序比对分析;对诱导耐药菌株及其对应敏感菌株进行生长曲线分析、生物膜形成能力检测及体外竞争和抗血清试验,分析研究多黏菌素耐药肺炎克雷伯菌的适合度代价.结果 3株诱导耐药株中均检出pmrB(T157P)突变,在诱导株FK713R和FK729R携带的mgrB基因中分别检出ISkpn14和IS51ike插入序列.诱导耐药株与敏感株相比,24h生长曲线未发现明显差异;生物膜形成能力检测结果发现诱导耐药株与敏感株生物膜形成能力无明显差异;3株菌获得多黏菌素耐药后均表现出一定程度的体外竞争缺陷,竞争指数(CI值)分别为0.01、0.54和5× 10-4;3株诱导耐药菌中有2株(FK713R和FK729R)与其敏感菌相比出现抗血清作用增强现象.结论 肺炎克雷伯菌获得多黏菌素耐药后会出现一定的适合度改变,不同的耐药机制可能会引起不同的适合度表现.

芦荟大黄素在体外诱导人舌癌及肺癌肿瘤细胞凋亡的初步研究

树突状细胞体外诱导方案的对比

目的 探讨并比较不同细胞因子组合、诱导时间对树突状细胞(DC)体外诱导、成熟,分泌细胞因子水平和刺激淋巴细胞增殖能力的影响,为建立DC体外高效、规模化培育体系提供依据.方法 分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),贴壁法获得DC前体细胞,用白细胞介素4(IL-4)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导2d,将其分为6组.A组加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1α和前列腺素E2(PGE2);B组加入α干扰素(IFN-α);C组加入脂多糖(LPS);3组细胞继续培育2d.D～F组细胞先进行1/3体积换液,24h后,分别再加入上述A～C组的成熟因子,再继续诱导2d.分别收获各组上清和细胞,进行细胞计数,采用流式细胞术进行表型分析;采用ELISA检测各组DC分泌IL-12p70的水平、采用细胞增殖检测试剂盒刺激淋巴细胞增殖的能力.结果 6组体外诱导体系均能培育出形态学类似DC的细胞,DC数量与纯度(均达到96％以上),各组间无显著性差异.A组与D组比较:CD40、CD80、CD83、CD86共刺激分子表达水平相近,但D组DC分泌IL-12p70水平高于A组;B组与E组比较:E组DC的CD86表达水平显著高于B组,CD80表达量略高于B组,2组DC分泌IL-12p70的水平相近;C组与F组比较:CD40、CD80、CD83、CD86共刺激分子表达水平和分泌IL-12p70的水平均相近.6组DC刺激淋巴细胞增殖水平均相近.三种不同成熟因子(组合)比较:B组DC共刺激分子CD80水平明显低于C组和A组,且IL-12p70分泌水平低,而C组和A组共刺激分子表达水平与IL-12p70分泌水平相近.结论 TNF-α、IL-1α和PGE-2三种细胞因子联合以及LPS可有效地诱导DC表达高水平免疫共刺激分子、分泌高水平IL-12p70.

细胞因子体外诱导外胚间充质干细胞向树突状细胞分化

目的:探讨外胚间充质干细胞(EMSC)向树突状细胞(DCs)分化的能力.方法:利用基因重组大鼠GM-CSF和IL-3连续诱导17 d,在第19天加入基因重组大鼠TNF-α继续诱导,观察其形态、超微结构、表面标记、混合淋巴细胞反应、IL-12分泌功能等,以SD大鼠骨髓间充质干细胞向DC分化作为对照.结果:经过诱导的EMSC出现细长伪足和毛刺,变为半贴壁状态；扫描电镜显示长的细胞突起和许多毛刺；其表面标记与骨髓来源的DC相似；混合淋巴细胞反应证实其可以刺激淋巴细胞增殖；诱导后的EMSC有分泌IL-12功能.结论:EMSC在体外经诱导可向DC分化.

体外诱导生成血小板的研究进展

血小板是大量存在于哺乳动物血液中的无核盘状小细胞,它来源于骨髓造血组织中的巨核细胞,具有止血、凝血,促进伤口愈合及参与免疫炎症反应等重要作用.本文主要是对体外条件下诱导干细胞生成血小板以及诱导培养体系中细胞因子的作用进行综述.

Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白2A重组痘苗病毒转染DC及特异性CTL的体外诱导

通过EB病毒LMP2A重组痘苗病毒转染的DCS体外诱导LMP2A特异性CTL,并通过GM-CSF、IL-4和TNF-a培养体系,我们诱导出了人外周血单核细胞来源的DC.同时选用在鼻咽癌患者中表达的EB病毒潜伏蛋白之一LMP2A作为靶基因,利用重组痘苗病毒转染诱导的DCS.DCS与自体PBMCS混合培养,在IL-2的刺激作用下获得特异性CTL.结果如下:

白念珠菌对氟康唑耐药模型体外诱导方式的比较研究

目的 探讨白念珠菌耐药模型体外诱导方式,从而获得佳耐药模型,为研究念珠菌耐药机理奠定基础.方法 以氟康唑为诱导药物,选取临床分离的白念珠菌敏感株,分别采用相同药物浓度传代法、氟康唑浓度递增法和强的松龙干预氟康唑浓度递增法,对其进行人工体外诱导.结果 上述三种诱导方式均能使白念珠菌对氟康唑产生耐药,只是在药物的浓度和传代的次数所形成的耐药性时间不同.相同药物浓度传代法,4种氟康唑浓度分别于第8代(34d),12代(40d),16代(42d),20代(48d)呈耐药性;在氟康唑浓度递增法和强的松龙干预氟康唑浓度递增法,当氟康唑浓度递增至32μg/ml时,均能使白念珠菌产生耐药;对经三种不同方式诱导的终耐药株进行诱导耐药株的稳定性实验,当诱导耐药株传至16代时,相同药物浓度传代法和药物浓度递增法MIC值有不同程度的下降;而强的松龙干预药物浓度递增法,将诱导株传至20代时,MIC值无明显变化.结论 三种诱导方式均可获得耐氟康唑耐药模型,浓度递增法比相同浓度传代法,操作步骤少,耐药形成快,加上强的松龙干预,所形成的耐药株耐药性较稳定,为探讨念珠菌感染与预防及其耐药机制研究奠定基础.

PHA-CD3AK细胞的体外诱导及其生物学特性初步研究

目的:研究PHA-CD3AK细胞的体外诱导方法及其生物学特性,并与LAK细胞进行比较.方法:分离人外周血单个核细胞(PBMC),采用植物血凝素(PHA)、单克隆抗体(anti-CD3McAb)和基因重组人白细胞介素2(rhIL-2)、共同诱导制备PHA-CD3AK细胞;应用流式法分析PHA-CD3AK细胞的免疫表型、乳酸脱氢酶法(LDH)检测PHA-CD3AK细胞的杀伤活性,并观察其形态;吉姆萨染色法观察其核型.结果:微量anti-CD3McAb(0.05μg/ml)辅以少量rhIL-2(300U/ml)和PHA(100μg/ml)共同培养,即能诱导和大量扩增PHA-CD3AK细胞,其扩增倍数显著高于LAK细胞,维持高扩增的时间也远较LAK细胞持久;当效靶细胞比为80:1时,PHA-CD3AK细胞对体外肿瘤细胞(K562)杀伤的百分率为56.5%;免疫表型检测PHA-CDB AK细胞中CD3+、CD4+、CD8+细胞的比率分别为(86.5±5.89)%、(38.20±5.27)%、(42.63±3.50)%;核型为正常二倍体,染色体数目为46条.结论:PHA-CD3AK细胞是以CD3+、CD4+、CD8+细胞为主的异质细胞群,并具有淋巴母细胞样特征,PHA-CD3AK细胞为正常二倍体细胞.PHA-CD3AK细胞是易于体外诱导、扩增能力强,体外存活时间长、杀瘤活性高的一种具有广阔应用前景的肿瘤过继免疫效应细胞.

体外诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)是从着床前胚胎内细胞团(inner cell mass,ICM)中分离出来的能在体外培养的一种全能干细胞.它具有在体外可以大量增殖并保持未分化状态和在一定条件下能向内、中、外三个胚层组织和细胞分化的生物学特性.胚胎干细胞也易于进行基因改造操作和制造嵌合体动物,从而成为细胞与个体之间的桥梁[1]以及临床移植治疗新的细胞来源.1998年Thomoson等[2]与Shamblott等[3]分别建立了来源于人类胚细胞群和原始生殖细胞的人胚胎干细胞系,科学家们看到了在体外培育所需的组织细胞以取代患者体内的病损组织细胞来治疗多种疑难病的曙光.

耐头孢曲松淋球菌菌株的体外人工诱导及多重耐药现象

目的 探讨体外人工诱导耐头孢曲松淋球菌的可行性,为研究淋球菌耐头孢曲松的机制提供实验菌株. 方法将对头孢曲松敏感的标准株ATCC49226(MIC 0.004ug/mL)和临床株ZSSY00205(MIC 0.25ug/mL)以头孢曲松次抑菌浓度法连续传代培养,定期监测生物学和分子生物学特性,诱导耐药成功后检测耐药菌株的稳定性,并分析诱导耐药前、后菌株RAPD图谱的改变及对其它抗菌药物耐药性的改变. 结果诱导后菌株ATCC49226和ZSSY00205对头孢曲松的MIC值是诱导前的125倍,诱导前、后菌株RAPD图谱未见明显改变,但头孢曲松诱导耐药后的淋球菌对青霉素、四环素、红霉素和环丙沙星的敏感性下降. 结论体外头孢曲松次抑菌浓度法可诱导产生头孢曲松耐药株,淋球菌对头孢曲松产生耐药的同时,可对包括青霉素、四环素、红霉素、喹诺酮在内的多种抗菌药物产生耐药或耐药性增加,即多重耐药现象.

大鼠骨髓间充质干细胞诱导为胰岛样细胞体外实验

目的:探讨骨髓间允质十细胞(BMSCs)在不同葡萄糖浓度培养基中诱导效果的差异.方法:采用电镜观察细胞形态学变化、舣硫腙(DTZ)染色鉴定胰岛素分泌细胞的存在;放射免疫分析法观察诱导后BMSCs细胞对葡萄糖刺激试验的反应;免疫细胞化学分析鉴定细胞内胰岛素分泌以及Real-time PCR鉴定胰岛B细胞相关基因mRNA表达水平.结果:电镜观察可见诱导后的细胞具备典型分泌细胞特点,DTZ染色显示各诱导组细胞团为棕红色,细胞浆中富含锌离子,而对照组则无染色,表明胰岛索分泌样细胞的存在.经不同浓度葡萄糖诱导后其吸光度值A值:低糖5.5 mmoL/L诱导组(4.75±1.87).中糖11.1 mmoi/L诱导组(i0.96±2.06),高糖25mmol/L诱导组(12.53 4±2.04),且各诱导组吸光度值A值随着培养基葡萄糖浓度的不断增加,A值也在不断增高.Real-time PCR定量分析结果显示,诱导后胰岛B细胞相关基因GK,PDX-1,ngn3,GLP-1 mRNA的表达水平变化显著,差异具有统计学意义(P<0.01).胰岛素分泌量高糖25 mmol/L诱导组(6.64±0.46)IU/L高于其他各组,差异具显著性(P<0.01).结论:培养基葡萄糖浓度对大鼠BMSCs诱导为胰岛样细胞具有一定影响,以高糖培养基的诱导效果较好.

MRSA-PBP2a蛋白的体外诱导、抗体制备及鉴定

目的:探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus, MRSA)蛋白的体外诱导;抗MRSA-PBP2a(pencillin binding protein 2a, PBP2a)蛋白抗体的制备及效价鉴定. 方法:采用NCCLS推荐的琼脂板稀释法和PCR法筛选MRSA,以β-内酰胺抗生素作为诱导剂,进行体外诱导产生PBP2a蛋白. 免疫家兔后产生抗MRSA-PBP2a蛋白抗体,采全血分离血清, 用改良双向免疫扩散法进行抗体滴度测定. 结果:11株临床分离的金葡菌采用二种方法均检测出2株MRSA,SDS-PAGE和Western blot结果均显示从MRSA菌株中均能诱导出了PBP2a蛋白;免疫后均能产生较高的效价抗体,分别为1: 32和1: 64. 结论:成功诱导出产生耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白菌株,并制备获得PBP2a蛋白,以及制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白抗体,为研究MRSA-PBP2a蛋白活性、MRSA的免疫治疗和MRSA快速鉴定方法学的建立奠定基础.

转4-1BBL基因小鼠肝癌细胞瘤苗体外诱导抗肿瘤免疫应答的研究

卡介苗生产中细菌生长的变化与免疫应答的相关性

卡介苗接种对总体生存率具有有益的非特异性作用。卡介苗接种后人体对结核菌素试验产生阳性反应并且有疤痕形成与提高生存数相关。在一项随机的现场研究中，初生低体重新生儿初生时接种卡介苗或延迟接种卡介苗。卡介苗的生产者测试了生长率相对较慢的时期制备的卡介苗。作者研究了卡介苗生产制备期间卡介苗的生长率与体内和体外诱导免疫应答之间的关联性。

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究进展

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有自我复制和跨胚层多向分化的潜能,可以被诱导分化为神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞等,同时它的来源方便,易于分离、培养、扩增和纯化,免疫原性弱,免疫耐受性强,体外基因转染率高,并能稳定高效表达外源基因等优点,是目前较为理想的种子细胞,在临床应用方面特别是在治疗中枢神经系统疾病中有着广阔的应用前景[¨.BMSCs用于治疗中枢神经系统疾病的前提是能大量诱导分化为神经细胞,本文就体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究进展作一综述.

CIK细胞杀瘤实验前后细胞表型与细胞毒性相关性研究

目的 为了分析体外细胞因子诱导培养EIK细胞在体外杀瘤实验中的细胞表型变化与其杀瘤活性的相关性及为临床过继免疫治疗提供实验依据.方法 采用体外诱导方法 扩增培养正常人外周血淋巴细胞及单个核细胞,用CCK-8试剂检测培养14d的CIK细胞对SPC-A-1和BGC-823肿瘤细胞的细胞毒活性,应用流式细胞术测定杀瘤实验前后CD3<'+>等6种不同表型细胞百分率的变化.结果 在与效靶比成正比的条件下,体外实验CIK细胞对两种肿瘤细胞的杀伤率都与CD3<'+>CD4<+>,CD3<'+>CD4<'->CD8<'->细胞比例变化呈正相关(P<0.05),都与CD3<'+>CD25<'+>,CD3<'+>CD28<'+>,CD3<'+>CD25<'+>CD28<'+>细胞比例变化呈负相关(P<0.05),对SPC-A-1细胞的杀瘤率与CD3<'+>CD16<'+>CD56<'+>呈正相关(P<0.05).结论 本研究表明靶细胞抗原在活化细胞中起重要作用,测定培养细胞活化相关表型可以间接监测其杀瘤能力,为临床CIK细胞过继免疫治疗的应用提供实验依据.

树突状细胞体外诱导分化扩增方法的研究进展

树突状细胞(dendritic cells,DCs)是一种重要的免疫辅佐细胞,是体内广泛的专职抗原递呈细胞(profession-alantigen presenting cells),具有强大的激活静息T细胞,激发初次免疫应答的独特功效,在肿瘤免疫治疗中,具有潜在的应用价值.