Flt3-L与GM-CSF体外诱导急性髓系白血病患者DC功能比较研究

树突状细胞(dendritic cell,DC)是迄今已知功能强的抗原提呈细胞,而成为肿瘤生物学治疗领域备受瞩目的焦点[1].fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L、简称FL)是一种新近发现的细胞因子,具有强大的刺激多能造血干细胞增殖的能力[2],Flt3-L和GM-CSF作为诱导DC的两种基本生长因子,研究比较二者在生物治疗中的作用特点,显然对更好的实现它们在临床中的应用具有重要的现实意义.

人外周血单核细胞来源的DC体外分化成熟影响因素的研究

目的:探讨不同因素对人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)体外分化成熟的影响.方法:通过流式细胞仪表型分析、混合淋巴细胞反应、抗原摄取能力检测、DC对T细胞的趋化能力及对IL-10的拮抗效应的测定,研究了TNF-α,FL,sCD40L,CD40mAb,gp130,IL-10等不同因素对DC的体外分化成熟及功能的影响.结果:CD40信号和TNF-α都可以有效地使DC上调表达共刺激分子CD80,CD86并进而促进DC激发T细胞的增殖和活化及对T淋巴细胞的趋化作用,但在体外培养体系中,sCD40L能有效地拮抗IL-10的抑制效应,而TNF-α则明显不如sCD40L有效;激发型gp130单克隆抗体和人重组FL可以显著地促进DC的体外扩增,但是无明显地促进DC分化成熟和促进DC激发T细胞的功能.结论:CD40和TNF-α都具有促进DC分化、成熟的能力,但CD40的作用明显优于TNF-α.

体外诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的:探讨成体骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的可行性,为心血管组织工程提供新的种子细胞来源.方法:骨髓穿刺抽取绵羊骨髓液,密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞,通过贴壁培养纯化骨髓基质干细胞.以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M1 99培养液培养原代细胞,并以VEGF诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化.通过CD34、CD31流式细胞仪分析,免疫组化CD34、CD31、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞,UEA结合实验及NO含量测定评价内皮细胞功能.结果:骨髓基质干细胞表达α-SMA,不表达CD34和CD31.体外定向诱导2周后分化为内皮细胞,呈梭形,表达CD34和CD31及Ⅷ因子相关抗原,UEA结合试验阳性,并具有分泌NO的功能.结论:体外培养条件下骨髓基质干细胞能够分化为内皮细胞,并具有成熟内皮细胞的生物学特性和功能.

WHBE兔骨髓、外周血和脾脏来源树突状细胞的比较

目的 建立大耳白黑眼兔(WHBE兔)树突状细胞(DC)体外诱生培养的经济有效的方法,为进一步实验奠定基础.方法 分离WHBE兔骨髓、外周血和脾脏三种来源单核细胞分别作为DC 的前体细胞,以GM-CSF和IL-4联合诱生未成熟DC,并经LPS刺激分化成熟.通过DC形态学和超微结构观察、表型鉴定以及同种异体混合淋巴细胞反应检测,比较三种DC的生物学特征和免疫功能.结果 三种来源单核细胞经LPS刺激后其表面均显示出明显的树枝状突起,外周血和脾脏的DC分化速度较骨髓稍快,均能成功诱生出106～107数量级的DC,其中外周血来源获得的数量多.CD86分子表达显著升高,脾脏来源DC的表达稍高于另外两组.具有显著刺激T细胞增殖的能力(P＜0.05),但三组之间无显著性差异(P＞0.05).结论 采集外周血单核细胞体外诱导扩增DC是获得WHBE兔树突状细胞简便经济的手段.

体外诱导骨髓基质细胞向心肌细胞分化的研究

体外诱导血红素氧合酶-1表达对抗PDGF-BB诱导的大鼠血管平滑肌细胞表型转化的作用\川崎病与血管紧张素转化酶基因多态性的研究

氟喹诺酮类药物体外多步诱导鲍曼不动杆菌产生交叉耐药性的研究

目的 探讨临床分离的鲍曼不动杆菌敏感株在诱导条件下对氟喹诺酮类药物交叉耐药情况.方法 采用环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)和加替沙星(GAT)分别对5株鲍曼不动杆菌进行体外多步诱导,采用琼脂平板2倍稀释法测定诱导前后CIP、LVX及GAT对鲍曼不动杆菌的低抑菌浓度(川C).PCR扩增诱导前后菌株gyrA和parC基因并进行酶切分析,选取PCR扩增产物进行测序.结果 5株鲍曼不动杆菌敏感菌株经体外诱导均产生了耐药现象;鲍曼不动杆菌经氟喹诺酮类药物诱导后MIC显著升高(MIC由0.025～2μg/mL升高至8～128μg/mL);经1种药物诱导耐药后对另外2种药物也产生了不同程度的耐药;PCR-RFLP显示,诱导前菌株gyrA基因、parC基因均能被Hinf I酶切,诱导后均不能被Hinf I酶切;测序发现诱导后菌株的gyrA基因和parC基因均存在突变.结论 在体外证实鲍曼不动杆菌对氟喹诺酮类药物逐步耐药的进程,并发现诱导可使菌株gyrA和parC基因产生突变.

死亡配体TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的研究

肿瘤坏死因子(TNF)是一个超家族,具有抗肿瘤作用,既往发现的TNF及Fas配体等虽然有抗肿瘤作用,但因细胞毒性作用甚强,对正常组织损伤太大,限制了其在临床应用.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是近发现的TNF家族新成员,因其独特结构和作用特点,有可能成为临床上重要抗肿瘤因子[1].许多研究证实:TRAIL可诱导许多恶性肿瘤细胞凋亡,包括血液系统恶性肿瘤细胞、乳腺癌等[2,3].本实验将观察TRAIL体外诱导胃癌7901细胞凋亡作用,为TRAIL临床应用提供理论基础.

特比萘芬体外诱导白念珠菌耐药性研究

随着白念珠菌对唑类耐药现象的增多,特比萘芬已被临床应用于念珠菌病的治疗.我们通过特比萘芬不同药物浓度体外诱导白念珠菌耐药菌株,以期为其耐药性研究提供一定的理论依据.

胶原糖化体外诱导皮肤老化

近来由于寿命的大幅度延长,老化引起了研究者的巨大兴趣.老化是一种复杂的过程,由多种机制参与,包括基因组突变的累积、有毒代谢产物的堆积、激素减少及糖化导致的大分子交联等.皮肤因为受到内在因素(遗传)和外在因素(日光、化学药物和过敏原等)的双重影响,成为研究老化的重要模型.

CXCR4基因转染的猪BMSCs体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的:探讨基质细胞衍生因子-1(SDF-1)受体CXCR4基因转染的猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外诱导分化为心肌样细胞的可行性.方法:按照Nance方法培养BMSCs,转染带荧光的CXCR4基因,流式细胞仪检测转染后BMSCs的细胞周期,用5-氮胞苷(5-aza)诱导,并行结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I免疫组化鉴定.对照组为未转染CXCR4基因的BMSCs.结果:体外培养的原代BMSCs 10～14d达到融合,CXCR4基因转染后的BMSCs能成功表达CXCR4,转染前后细胞周期无明显改变.与对照组相同,经5-aza刺激后,部分BMSCs成梭形,结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I免疫组化染色均为阳性.结论:CXCR4基因转染的猪BMSCs在体外条件下生长稳定,传代后仍保持未分化状态,有分化成心肌样细胞的潜能.

LFA-1对小鼠Treg细胞功能可塑性的影响及其机制探讨

目的:淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)对淋巴细胞的分化、迁移及功能有重要影响.体外探讨LFA-1对iTreg细胞可塑性的影响和作用机制.方法:体外诱导产生纯度较高的野生组(wild type,WT)小鼠iTreg细胞及LFA-1基因敲除组(LFA-1-/-组),将以上2种细胞置于含有Ⅱ-6、IL-23、TGF-β的完全培养基中,于第8天通过流式检测Ⅱ-17、Foxp3共表达的情况,PCR检测STAT3、ROR-γt前后表达量的变化,ELISA检测细胞因子Ⅱ-10、Ⅱ.-17水平.结果:野生组(wild type,WT)及LFA-1基因敲除组(LFA-1-/-组)小鼠Treg细胞在炎性环境中均展现出可塑性,LFA-1-/-组小鼠Ⅱ-17/Foxp3共表达高于WT组小鼠.real-timePCR显示与WT组相比,LFA-1-/-组小鼠ROR-γ t、STAT3表达高于WT组(P＜0.001).与空白对照组相比,炎性环境中Treg细胞分泌IL-17增加,分泌IL-10减少;且这种改变在LFA-1组小鼠Treg细胞中更为显著(P＜0.001).结论:LFA-1可能通过影响转录因子ROR-γt、STAT3表达水平影响Treg细胞的可塑性.

不同培养方法对体外诱导分化Th17细胞的影响

目的:Th17细胞缺乏特异性表面标记,难以分离纯化活细胞,通过调整细胞因子浓度和不同培养方法,以获得高纯度Th17细胞亚群.方法:选用C57BL/6J小鼠脾脏获得单个核细胞,磁珠分选获得CD4+、CD44-Naive T细胞.建立不同Th17诱导培养体系,通过流式细胞术检测获得Th17细胞的比例,荧光定量PCR方法检测ROR-γt、IL-17 mRNA表达水平,ELISA方法检测细胞培养上清中IL-17浓度,以寻找佳培养条件.结果:TGF-β+IL-6+IL-23可诱导Th17细胞,但比例较低;加入TNF-α、IL-1β、anti-IFN-γ、anti-IL-2可进一步提高Th17比例,但后期培养呈衰减趋势;使用U型96孑孔板培养Th17细胞明显优于24孔板培养,细胞分化呈稳定上升趋势,培养第9天Th17细胞可达(91.85±1.05)％.IL-17、ROR-γt mRNA与Naive T细胞相比明显上调(P＜ 0.001),IFN-γ、IL-4、Foxp3 mRNA表达量低(P＜ 0.001),细胞培养上清液中IL-17浓度明显升高(P＜ 0.001).结论:调整细胞因子诱导方案、缩小培养面积可不同程度提高Th17细胞诱导比率,且培养面积的影响作用更为显著.

小鼠骨髓源嗜酸性粒细胞的体外诱导与鉴定

目的 分离小鼠骨髓细胞并将其诱导为嗜酸性粒细胞,为后续嗜酸性粒细胞功能探讨奠定基础.方法 剖杀小鼠,分离其股骨骨髓细胞,用rmIL-5等对其进行定向诱导分化,用瑞氏染液及Chromotrope 2R染液对所诱导细胞进行染色观察,并利用流式细胞术对其表面CCR3(C-C motif chemokine receptor 3)/Siglec-F(sialic acid binding Ig like lectin 5)等分子的表达予以检测,从细胞形态学及表面分子表达情况对所诱导的细胞予以鉴定.结果 瑞氏染色及Chromotrope 2R染色可见嗜酸性粒细胞典型形态,流式细胞术检测Siglec-F及CCR3表达水平明显升高.结论 本研究利用rmIL-5在体外成功获得较高纯度的小鼠骨髓来源的嗜酸性粒细胞.

FAC对L_(1210)荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用及对免疫功能的影响

沙苑子具有补肝、益肾、固精、缩尿的作用[1].FAC(flavoroids of astragali complanali)是沙苑子的乙醇提取物,其主要成分是总黄酮.研究表明FAC具有体外诱导白血病细胞凋亡、体内抗S180、H22肿瘤生长的作用;其抗肿瘤同时能显著增加小鼠胸腺、脾脏湿重[2,3].本文探讨FAC对L_(1210)倚瘤小鼠腹水生长及相关免疫功能指标的影响.

亚低杀菌浓度阿莫西林对体外诱导金黄色葡萄球菌标准菌株的耐药研究

目的：观察亚低杀菌浓度（ Sub－minimum bactericidal concentration，Sub－MBC）阿莫西林对金黄色葡萄球菌标准菌株的耐药性影响。方法以金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 29213）为研究对象，阿莫西林为抗菌药物，以微量稀释法定量检测不同诱导天数MBC值，采用1／2MBC浓度对金黄色葡萄球菌进行30 d多步体外诱导实验，观察金黄色葡萄球菌标准菌株MBC变化，以全自动微生物药敏鉴定仪对终诱导后菌株进行阿莫西林耐药性分析。结果金黄色葡萄球菌标准菌株MBC值阿莫西林体外诱导7 d即显著升高，诱导30 d升高至原始菌株MBC的32倍；经全自动药敏分析仪鉴定诱导出的耐药菌株对阿莫西林耐药。结论亚低杀菌浓度阿莫西林可体外诱导金黄色葡萄球菌标准菌株出现耐药，且耐药性随亚低杀菌浓度诱导时间增加而升高，提示合理选择抗菌药物使用剂量可作为预防细菌耐药重要措施。

人骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞分化的实验研究

目的 创伤等因素造成的关节软骨的损伤和退变是骨科常见和难以解决的问题之一.干细胞尤其是骨髓来源干细胞的研究促进了组织工程在骨关节领域的发展.文中研究体外单层培养条件下,成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)经诱导定向分化软骨细胞可行性. 方法 用全血贴壁法分离培养BMSC,并传代扩增后,用单层培养法在软骨诱导剂下进行诱导培养21d,以常规培养液培养的BMSC作为阴性对照.光镜下观察诱导细胞形态学的改变,苏木素-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化等方法检测诱导细胞的分泌功能.　结果 BMSC经21d的单层诱导培养后,细胞形态由长梭形向多角形类圆形转变,细胞爬片甲苯胺蓝染色呈明显异染,Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学检测阳性,对照组阴性. 结论 成人BMSC在单层培养条件下可成功诱导分化为软骨细胞.

氟喹诺酮类药物体外诱导大肠埃希菌耐药性变化

目的:近年来,由于E.coli对氟喹诺酮药物耐药现象日趋严重.文中研究3种氟喹诺酮药物体外诱导大肠埃希菌(E.coli)耐药性,为临床合理使用抗菌药和控制E.coli感染提供指导. 方法:采用环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)和加替沙星(CAT)分别对10株E.coli进行体外分步诱导,采用琼脂平板二倍稀释法测定诱导前后CIP、LEV及GAT对E.coli的低抑菌浓度(MIC). 结果:E.coli经体外诱导产生获得高水平耐药株(MIC≥128μg/ml).经1种药物诱导耐药后也不同程度对另外2种药物耐药. 结论:大肠埃希菌经氟喹诺酮类药物诱导后MIC变化显著(比诱导前增加8～8205倍),从体外证实大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物逐步耐药的进程.

不同来源人树突状细胞的培养诱导及鉴定

目的 通过对不同来源的人树突状细胞的体外培养与诱导,建立树突状细胞的稳定体系,为更进一步实验打好基础.方法 分离人外周血单个核细胞(PBMC),用不同树突状细胞亚群的特异性表面标记抗体磁珠分离树突状细胞前体,通过加入不同的刺激分子,分别诱导未成熟、成熟及活化等不同阶段的树突状细胞.结果 与未成熟树突状细胞相比,成熟活化型树突状细胞表达HLA-DR、CD86以及CD40等共刺激分子明显升高,其中MoDC对成熟标记物CD83的表达水平亦较高.此外,两者在形态上也有明显的差异.结论 通过对不同亚群树突状细胞的体外诱导、培养和鉴定,建立了较为成熟的研究树突状细胞的平台,为深入开展工作打下基础.

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是否能体外诱导分化为心肌样细胞.方法 用浓度梯度法分离和纯化Wistar大鼠MSCs,贴壁法培养,培养的第2代细胞分别用终浓度为0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 μmol/L的5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导分化,用光学显微镜观察细胞的形态并用免疫细胞化学方法鉴定细胞内的心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI).结果 以终浓度10.0 μmol/L 5-aza为诱导组,细胞从原来的梭形变为排列趋向较为一致的长梭形,且体积增大,诱导10 d后,细胞内cTnI蛋白染色阳性.终浓度为0、0.1、1.0 μmol/L组细胞形态变化不明显,细胞内cTnI染色阴性.终浓度为50.0、100.0 μmol/L组细胞死亡.结论 大鼠MSCs细胞可经5-aza诱导分化为心肌样细胞,且5-aza的佳诱导浓度为10.0 μmol/L.