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HNF1α基因克隆在不同分化程度胰腺癌细胞系中的表达
目的 克隆人胰腺癌相关易感基因HNF1α,并通过检测三种不同胰腺癌细胞系中HNF1α的表达,筛选出HNF1α低表达的胰腺癌细胞系,为进一步研究提供依据.方法 提取BxPC-3,PANC-1及SW-1990胰腺癌细胞系的总RNA,用RT-PCR方法扩增HNF1α基因,PCR产物及pcDNA3.1(+)经EcoR I/XhoI双酶切后,用T4 DNA连接酶连接,连接产物转化细菌后挑选克隆,进行测序鉴定.通过Real-time PCR及Western blot方法比较HNF1αmRNA及蛋白在不同胰腺癌细胞系中的表达量.结果 克隆得到了1914 bp的HNF1α基因cDNA序列,与已发表的HNF1α同源性为99％.BxPC-3,PANC-1及SW-1990细胞HNF1αmRNA相对表达量分别为(6.52±1.11),(3.09±0.54)及1,差异有统计学意义(P<0.05).Western blot法检测HNF1α蛋白表达水平显示,在SW-1990细胞中HNF1α蛋白有少量表达,而在PANC-1,BxPC-3细胞系中HNF1α蛋白表达依次增高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 HNF1α表达水平与胰腺癌细胞分化程度呈明显正相关,HNF1αmRNA及蛋白在SW-1990细胞系中均呈低表达,因此该细胞系可作为良好的研究工具,为进一步将HNF1α转染该细胞系,以研究HNF1α对胰腺癌的抑癌作用提供依据.
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CTX-M型阴沟肠杆菌的基因克隆及原核表达产物特性研究
目的 对阴沟肠杆菌所产CTX-M型β-内酰胺酶进行基因克隆、原核表达重组质粒的构建及其特性研究.方法 以产CTX-M型β-内酰胺酶的阴沟肠杆菌45号基因组DNA为模板,设计两对引物PCR扩增CTX-M,将其克隆入pGEM-T载体后测定该核苷酸序列.再将CTX-M基因克隆到pGEX-6P-3表达质粒并转入感受态BL21,选择阳性菌落进行药物敏感试验和酶动力学检测.结果 PCR扩增出大小为876 bp和1 067 bp的基因片段,与GenBank上CTX-M-9和CTX-M-3酶的基因序列同源性为100%.CTX-M-3型重组菌株药敏试验结果 与原菌株相比,对青霉素类和头孢噻肟具有明显的水解作用,第三、四代头孢菌素对之较为稳定,动力学结果与酶稳定性结果基本一致.结论 重组质粒pGEX-6P-3/CTX-M构建成功,CTX-M-3型重组菌株与原菌株比较,对β-内酰胺类抗生素的敏感性和稳定性增加,亲和力下降.
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人Ⅰ型干扰素受体亚基稳定表达真核细胞的筛选及鉴定
目的:筛选及鉴定人Ⅰ型干扰素受体亚基(IFNAR1)稳定表达真核细胞.方法:体外扩增IFNAR1基因片段,将双酶切后扩增片段和pcDNA3.1(+)连接构建重组质粒pcDNA3.1-IFNAR1,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定.重组质粒pcDNA3.1-IFNAR1转染肝癌细胞系HepG2,新霉素筛选挑取阳性克隆细胞,蛋白质印迹试验(Western blotting)分析阳性细胞IFNAR1表达水平.结果:经双酶切和测序验证pcDNA3.1-IFNAR1重组质粒构建成功.pcDNA3.1-IFNAR1转染HepG2经新霉素筛选后获得稳定表达细胞系,蛋白质印迹试验(Westem blotting)证实这些细胞具有较好蛋白表达水平.结论:体外成功构建不同IFNAR1稳定表达水平的HepG2细胞.
关键词： 人Ⅰ型干扰素受体亚基 IFNAR1基因 重组质粒 稳定表达 真核细胞 -
BCSG1基因RNAi表达载体的构建与鉴定
目的:构建乳腺癌特异性基因(BCSG1) RNAi重组质粒,并检测其在三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-321中对BCSG1基因表达的干扰效果和对细胞增殖的影响.方法:将两组干扰片段BCSG1-R1、BCSG1-R2及阴性对照片段BCSG1-C分别克隆入pGenesil-1穿梭质粒,经酶切鉴定及测序后,将测序正确的克隆转染入大肠杆菌DH5α中进行扩增Real-time PCR检测重组质粒转染MDA-MB-321细胞后,各组细胞内BCSG1-mRNA表达水平,Transwell细胞侵袭实验检测重组质粒对MDA-MB-321细胞侵袭能力的影响.结果:成功将干扰片段和阴性对照片段克隆入pGenesil-1质粒,构建出pGenesil-1 -BCSG1-R1、pGenesil-1-BCSG1-R2和pGenesil-1-BCSG1-C重组质粒.与对照组相比,BCSG1-R1和BCSG1-R2组的BCSG1-mRNA表达水平明显下调(P＜0.05);干扰后,MDA-MB-321细胞侵袭能力明显下降(P＜0.05).结论:成功构建BCSG1-RNAi重组质粒,可有效下调三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-321内BCSG1的表达及细胞的侵袭能力.
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肠致病性大肠埃希菌EspB基因的体外诱导表达研究
目的:研究肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli,EPEC) EspB基因的体外诱导表达情况,获得纯化的EspB蛋白.方法:体外构建重组质粒pET-28a-EspB,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒并行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定.重组质粒pET-28a-EspB经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹试验(Western blot)分析.pET-28a-EspB表达产物再次经纯化,获得的纯化蛋白进一步经SDS-PAGE和蛋白质Westernblotting分析验证.结果:经双酶切和测序验证pET-28a-EspB重组质粒构建成功.pET-28a-EspB重组质粒经IPTG诱导后,在诱导表达不同时间点,培养菌液、沉淀和上清中均有良好的蛋白表达.经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证我们获得了纯化的EspB蛋白.结论:体外可成功诱导EPEC EspB蛋白稳定高效表达并获得纯化EspB蛋白产物.
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小鼠TFEB基因重组腺相关病毒的构建及鉴定
目的 构建小鼠TFEB基因的重组8型腺相关病毒(AAV8),并通过感染293细胞观察TFEB表达情况.方法 将pUC57-mTFEB及载体质粒分别进行酶切、连接、转化,得到重组质粒pAAV-CMV-mTFEB,并进行PCR鉴定及测序;将鉴定正确重组质粒,进行AAV8病毒载体包装;正确包装病毒载体后,感染293细胞,通过Western blot观察TFEB基因在293细胞表达情况.结果 酶切鉴定和测序结果证明了pAAV-CMV-mTFEB病毒包装成功;病毒滴度4.65×1012vg/mL;细胞实验提示相比对照组,实验组TFEB基因表达水平升高6倍余(P＜0.01).结论 rAAV2/8-CMV-mTFEB构建及包装成功,并可以有效感染和表达.
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pHBAd-MCMV-GFP-NCAM1真核表达质粒的构建和鉴定
目的 将目的基因NCAM1与质粒载体pHBAd-MCMV-GFP进行连接,得到重组质粒pHBAd-MCMV-GFP-NCAM1.方法 对目的基因和质粒载体分别用内切酶NotI和Nsil进行双酶切,产物回收后进行连接、转化,得到重组质粒pHBAd-MCMV-GFP-NCAM1.转化后的菌液进行PCR阳性克隆鉴定,并对阳性样本进行测序.结果 首先对NCAM1进行扩增,从实验结果看符合预期效果,在双酶切、连接和转化实验后,对构建完成的重组质粒进行鉴定,PCR阳性克隆鉴定结果显示重组质粒构建成功,NCAM1已连接进入重组质粒中,测序的结果进一步印证阳性鉴定结果.结论 带有目的基因NCAM1的重组质粒构建成功.
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IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白靶向杀伤白血病细胞的新策略
目的:利用细胞因子-受体的特异性结合来靶向杀伤肿瘤是新一代导向杀伤策略.鉴于白血病细胞异常高地表达IL6/IL6R系统,而正常造血细胞几乎不表达抑或微量表达这一事实,我们率先在国际上开展了利用IL6/IL6R系统介导重组IL6-PE40外毒素融合蛋白特异性杀伤高表IL6R白血病新策略的科学性及可行性的探讨.方法:1. IL6-PE40的构建、表达及纯化:常规进行RNA提取、RT-PCR、质粒提取、酶切、回收、连接、转化、鉴定IL6、PE40及IL6-PE40融合基因的序列分析等.将所构建的含IL6-PE40重组质粒在大肠杆菌表达,用HPLC半制备分离其产物,SDS-PAGE及Western-blot鉴定.IL6-PE40的细胞毒活性采用[3H]-亮氨酸掺入U266骨髓瘤细胞检测.
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问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121的初步研究
钩端螺旋体病的传染和流行常给人类生命及畜牧业生产造成严重危害.我国曾发生过数十次大规模钩端螺旋体病流行.作为我国两个流行菌型之一的问号赖型钩端螺旋体在生物学特性和致病性有其独特性,但其遗传学特性和致病机制尚不完全清楚.为了探讨问号赖型钩端螺旋体抗原基因的特点,应用六种常见内切酶(BamHI,Bgl Ⅱ,EcoRI, Hind Ⅲ, Pst Ⅰ, Pvu Ⅱ)对从问号赖型钩端螺旋体017株的基因文库中筛选出来的重组质粒pDL121外源基因进行酶谱分析,同时用Digoxin标记的pDL121外源基因片段作探针对不同种属的致病性钩端螺旋体和非致病性钩端螺旋体基因进行杂交分析.结果显示问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121外源基因没有6种内切酶的酶切位点,重组探针与致病性钩体(serovar lai strain 017, serovar hebdomadis strain 56 610, serovar pomona strain 56 608)有杂交信号,与非致病性钩体(serovar patoc strain Patoc Ⅰ, serovar illini strain 3055)无杂交信号,亦不识别大肠杆菌.结果提示重组质粒pDL121外源基因可能是问号赖型钩端螺旋体的一个新基因,进一步测序分析将揭示该基因本质,同时因该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体,提示其可用于钩端螺旋体病的早期诊断及钩端螺旋体的鉴定和分类.
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问号赖型钩端螺旋体23 kDa蛋白的免疫原性研究
钩端螺旋体病(简称钩体病)是分布广的一种人兽共患病,已有77个国家和地区有钩体病的流行,给人类和畜牧业造成了严重危害.为了控制钩体病流行,目前多采用全菌死疫苗.但是,全菌死疫苗免疫持久性不强,而且需多次注射,因而有严重的局限性.因此,寻找由钩体基因编码的保护性抗原,使之持久地抵抗侵入机体的钩体,已成为钩体病研究的课题.我们前文已报道问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121可表达被全钩抗血清识别的23 kDa蛋白(刘洪斌等,以Lambda gt11作载体构建赖型钩体基因文库及其重组质粒pDL121的克隆和在E.coli表达的研究.华西医科大学学报,1997, 28(1):18.为了探讨pDL121的1.0 kb 017株问号赖型钩端螺旋体DNA片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的候选,采用SDS-PAGE制备23 kDa蛋白,免疫日本大耳兔制备抗23 kDa抗血清,Western blot鉴定其免疫原性.结果显示:23 kDa重组抗原兔抗血清可识别pDL121体外表达23 kDa抗原产物和问号赖型钩端螺旋体017株超声抗原成份:用Western blot鉴定抗血清效价,其抗体滴度为1/12 800;用pDL121重组质粒主动免疫豚鼠,可使豚鼠抵抗强毒力株钩端螺旋体攻击,表现出免疫保护作用.本实验结果提示:该重组23 kDa抗原有良好的免疫原性,可能是赖型钩体017株的保护性抗原.
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大鼠β-防御素-2重组质粒的构建及转染表达
目的:为开展防御素基因转基因以增强粘膜抗感染能力的实验研究,本实验构建真核重组表达载体pBK-CMV-rBD2以进行COS-7细胞转染表达实验.方法:用RT-PCR法(引物含有EcoRI、HindⅢ酶切位点)从肺组织总RNA中扩增出rBD2基因全长cDNA片段,并克隆于pBK-CMV.通过脂质体转染法将pBK-CMV-rBD2导入COS-7细胞,采用RT-PCR法和琼脂糖弥散法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测rBD2的表达及活性.结果:所构建的真核表达重组载体pBK-CMV-rBD2转染COS-7细胞后呈现有效表达并具有活性.结论:提示通过基因转染的方法把防御素基因导入宿主细胞可能增强宿主粘膜抗感染能力,进一步的整体动物转基因抗感染实验研究具有可行性.
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结核分枝杆菌ESAT-6基因重组卡介苗的构建与鉴定
目的:ESAT-6是结核分枝杆菌的一种分泌性蛋白质,具有免疫保护作用,可作为抗结核病新疫苗的候选分子.而卡介苗由于缺失ESAT-6基因,不能产生该抗原蛋白.本研究旨在构建ESAT-6基因重组卡介苗,使其表达ESAT-6抗原,从而增强其免疫原性和免疫保护性,探索将该重组卡介苗用作新型结核病疫苗的可行性.方法:分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,经PCR扩增得到BCGα-抗原(α-Ag)信号肽序列和结核杆菌ESAT-6基因,将ESAT-6基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组,得到重组质粒pME.再将BCGα-Ag信号肽序列克隆至pME中,得到重组质粒pSME.后通过电穿孔法将pSME导入卡介苗中,并用抗性筛选、PCR扩增及打点杂交进行鉴定.结果:电转化后的卡介苗能在含10 mg/L卡那霉素的培养基上生长.以重组卡介苗总DNA为模板的PCR扩增得到阳性扩增带,大小与α-Ag信号肽序列加上ESAT-6基因的长度一致.打点杂交中探针与重组卡介苗显示阳性信号.结论:基因重组卡介苗构建成功,并有望分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT-6.该重组卡介苗既保留了卡介苗中原有的抗原,又增添了新的保护性抗原,且这种抗原可被广泛识别,能强烈诱导宿主T淋巴细胞增殖和持久的免疫记忆,因此ESAT-6重组卡介苗可能具有更好的免疫原性和保护力.本研究为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础.
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问号赖型钩端螺旋体内鞭毛与外膜基因融合DNA疫苗载体的构建
目的:为增强问号赖型钩端螺旋体(017株钩体)内鞭毛抗原(flaB)与外膜抗原(ompL1)的免疫保护作用,克服保护性免疫持续时间短的难题,应用DNA重组技术以pcDNA 3.1为载体构建-表达flaB与ompL1基因的融合DNA疫苗载体,以期注入肌体后能延长保护期,激发机体长期免疫.在pcDNA3.1载体上,ompL1与flaB前后相连,前者较后者先获得递呈,与钩体天然递呈过程相似,并且双嵌合基因可诱导机体产生针对2个不同抗原表位的抗体,从而增加免疫应答能力.pcDNA3.1载体能表达融合蛋白,并且具有CpG motifs,因而可发挥佐剂作用.方法:提取017株钩体基因组DNA,参照钩体特有的高度保守的flaB与ompL1序列,设计二对四条引物:P1、P2、P3、P4.flaB与ompL1已被证实是两个良好的钩体疫苗候选抗原.通过聚合酶链反应(PCR),P1、P2引物扩增017株钩体的ompL1抗原基因;P3、P4引物扩增钩体的flaB抗原基因,分别经双酶切,以pcDNA3.1载体,将ompL1与flaB顺次同时定向嵌入同一pcDNA3.1中,获得重组质粒(ompL1与flaB),并将其转入JM109宿主菌中.在设计引物时,分别在P2、P3引物中,采用多个结构简单又不易形成折叠的甘氨酸作为接头,以维持其空间构象,不影响自然折叠,保持天然活性.结果:经酶切鉴定证实:有一1.8 kb片段插入载体,进一步经酶切证实这一1.8 kb可被酶切为9.6 kb及8.5 kb的片段,与预期的片段大小一致.以嵌合重组质粒DNA为模板,经PCR证实:P1、P2引物扩增出9.6 kb片段;P3,P4引物扩增出一8.5 kb片段.重组质粒经DNA序列检测,其中ompL1与flaB序列与文献报道的完全一致.结论:表达017钩体flaB与ompL1抗原的融合蛋白的DNA疫苗载体构建成功,从而为下一步表达复合功能蛋白,进行钩体免疫保护性研究打下了基础.
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问号赖型钩体017株与七日热型钩体56610株内鞭毛蛋白基因的克隆及序列分析
目的:通过不同型钩体DNA序列分析筛选钩体基因疫苗的候选株,并从基因水平解释钩体血清型的特异性.方法:(1)酚、氯仿抽提法提取017株与56610株钩体基因组DNA.(2)分别以017株与56610株钩体基因组DNA为模板,PCR法扩增内鞭毛蛋白(flaB)基因.(3)T/A快速克隆法将两个flaB基因的PCR产物连接与Teasy-vector载体.(4)α-互补、PCR法初步筛选重组质粒.(5)碱裂解法小量提取质粒、酚切分析进一步鉴定重组质粒,确定外源基因插入方向.(6)双脱氧终止法对重组质粒的克隆化flaB基因进行测序.(7)应用软件对所测序列进行酶切位分析及编码蛋白的预测.(8)与已发表的钩体内鞭毛基因进行比较.结果:经鉴定获得了两个重组质粒pDHTF017与pDHTF610.pDHTF017中flaB基因为反向插入,pDHTF610中的flaB基因为正向插入.两个重组外源flaB基因长度均为852 bp,编码蛋白含283个氨基酸,预测分子量为31.5 kD左右.两个基因的限制性内切酶位点相似,含多个常见酶切位点.几个血清型钩体的flaB基因比较发现型间同源性很高(90%-99%),变异通常发生在固定位点,各型选择不同的固定位点.结论:(1)重组质粒pDHTF017与pDHTF610中的外源基因均为钩体的一种flaB基因; (2)flaB基因保守性强,可作为基因疫苗的靶基因;(3)七日热型钩体56610株的flaB基因有望成为核心抗原基因,可进行钩体疫苗的研究开发.
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结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究
目的:结核病疫情再度增高给结核病的防治提出了新的挑战,由于卡介苗对结核病的预防效果极不稳定,发展新型结核病疫苗势在必行,本研究通过对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行克隆与表达研究,旨在为结核病新型疫苗研制提供新的靶点.方法:根据结核杆菌H37Rv株免疫保护性抗原Ag85A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物,以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板通过PCR扩增获得具有完整开架读码框(ORF)的Ag85A抗原基因,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体pBKCMV构建重组质粒,重组质粒转入大肠杆菌后IPTG诱导表达,并对其表达产物进行Western-blotting分析.结果:①PCR扩增获得了具有完整开架读码框的Ag85A抗原基因;②构建了Ag85A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体;③Ag85A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达.结论:本研究成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础.
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重组质粒pEGFP-mDlX5的构建及其在SVZa神经干细胞中的表达研究
目的构建真核表达重组质粒pEGFP-mD1x5,并了解它在室管膜前下区(SVZa)神经干细胞(NSCs)中的mRNA及融合蛋白表达情况.方法运用DNA重组技术自原核表达载体上将小鼠来源的mD1x5基因克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)载体上,并用双酶切、测序进行鉴定;将重组质粒用电穿孔的方法转染SVZaNSCs,荧光显微镜下动态观察荧光变化情况;培养24h后提取转染细胞的总RNA及总蛋白,通过逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)了解其mRNA表达情况,用Western blot检测其蛋白表达情况.结果重组质粒通过双酶切产生了0.78kb目的插入片段及4.68kb载体片段;测序后证实0.78kb片段碱基序列与mDlx5基因完全同源;重组质粒转染SVZaNSCs 8 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,12 h后逐渐增多,24～48 h达高峰,且稳定表达较长时间;24 h后通过RT-PCR检测到mRNA表达,Westernblot检测到58 kD目的蛋白表达.结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-mDlx5通过鉴定,结构正确;转染到SVZaNSCs后能在其中表达、发挥功能,为后续研究奠定了基础.
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釉原蛋白基因表达质粒PcDNA3.1-AMG在小鼠肌肉组织中表达的研究
目的研究釉原蛋白(amelogenin,AMG)重组质粒PcDNA3.1-AMG能否在小鼠肌肉组织中获得正确表达.方法采用裸质粒直接注射法将溶于200 μL磷酸缓冲液中的100 μg质粒 PcDNA3.1(对照组)或PcDNA3.1-AMG(实验组)分别导入Balb/C小鼠的胫前肌内,注射后第3、7、14天分批处死小鼠,采用免疫组织化学染色法检测肌肉组织内釉原蛋白的表达.结果注射PcDNA3.1-AMG的肌肉组织的肌细胞和细胞间质中均检测到釉原蛋白的表达;而注射PcDNA3.1的肌肉组织的肌细胞和细胞间质中均未检测到釉原蛋白的表达.结论 PcDNA3.1-AMG成功地转染了肌肉细胞,并且外源基因能够在肌细胞内转录、翻译并正确表达釉原蛋白.
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小鼠DNAJB13与HK1的相互作用
目的 探讨小鼠DNAJB13与HK1是否具有相互作用.方法 应用双酶切连接方法构建pG EX-4T-1/Dnajb13原核表达载体,测序验证;重组质粒转化感受态细胞DH5α,用IPTG诱导融合蛋白GST-DNAJB13表达,采用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Western blotting分析蛋白和鉴定;提取小鼠睾丸蛋白,采用GST pull down检测DNAJB13与HK1是否具有相互作用.结果 成功构建pGEX-4T-1-Dnajb13重组质粒,测序结果与标准序列一致;转化重组质粒的大肠杆菌在37℃,IPTG浓度1mmol/L诱导下高效表达融合蛋白;GST pull down检测结果阳性,显示DNAJB13与HK1存在相互作用.结论 在小鼠睾丸中,DNAJB13与HK1存在相互作用,可能参与精子形成和精子运动.
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人甘油激酶慢病毒干涉载体的构建和表达
目的 构建人甘油激酶( GK)基因 RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,获得稳定下凋GK表达的慢病毒.方法 将具有干涉效果的siRNA序列克隆入慢病毒核心质粒pSicoR中,并转染293T细胞进行病毒包装,用慢病毒感染293T细胞并应用FACS测定病毒滴度.以GK 干涉慢病毒感染人肝细胞系L02细胞后,应用Western blotting方法检测GK的表达 结果 成功构建GK干涉慢病毒pSicoR-GK载体并获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达3×10 pfu/ml,GK蛋白质表达水平下调至对照的约20％.结论 成功构建人GK基因RNAi慢病毒,为后续GK生物学功能研究奠定基础.
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慢病毒介导的shRNA靶向干扰nestin鼻咽癌稳定细胞株的建立
目的 检测nestin基因在8种鼻咽癌细胞中的表达差异,寻找高表达的细胞株.构建nestin基因的shRNA表达载体,建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株.方法 应用Real-time PCR和免疫荧光技术检测nestin在鼻咽癌细胞株中的表达水平.构建带GFP的重组靶向nestin shRNA慢病毒表达质粒,筛选阳性克隆,测序鉴定.293T细胞包装病毒,收集病毒上清,测定滴度.经Real-time PCR内源筛靶,选择佳靶点.将重组慢病毒感染5-8F细胞,Western blotting和Real-time PCR检测nestin的表达.结果 在8种鼻咽癌细胞株中,5-8F细胞中nestin表达较高.PCR和测序验证重组质粒构建成功.慢病毒感染5-8F细胞后,与阴性对照组和空白组相比,nestin的mRNA和蛋白水平明显受到抑制.结论 成功构建了干扰nestin的慢病毒重组质粒,并建立了稳定靶向干扰nestin表达的5-8F鼻咽癌细胞株.
