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tccP2基因在临床分离肠致病性大肠埃希菌中的特征分析
目的 分析2001-2003年某省儿童医院分离的268株大肠埃希菌tccP2基因的携带情况及该基因的分子特征.方法 PCR方法筛查临床分离的268株大肠埃希菌中EHEC、EPEC菌株;再筛查tccP2基因的携带情况,克隆阳性菌株tccP2基因,并进行核苷酸测序,同时与GenBank数据库进行比对.结果 2001-2003年临床分离的菌株共检测到7株EPEC菌株,其中有2株菌tccP2基因阳性,长度分别为1458 bp,核苷酸和氨基酸的一致性为100%,与国际上公布的str.11128(O111:H-)菌株的tccP2基因比对发现核苷酸一致性为61.3%;氨基酸序列比对,发现其N-端与str.11128(O111:H-)菌株具有完全相同的特异的87个核苷酸序列,脯氨酸富集重复片段序列几乎一致,较str.11128(O111:H-)菌株多4个重复片段.结论 在中国临床分离的菌株中也存在具有tccP2基因的EPEC菌株,应进一步加大临床标本中该类菌株的分离与监测.
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北京地区腹泻就诊患者中肠致病性大肠埃希菌分离株特征分析
目的 分析北京市通州区腹泻就诊患者中肠致病性大肠埃希菌(EPEC)分离株的特征.方法 eaeA基因聚合酶链反应(PCR)扩增阳性的菌株,进行系统生化鉴定、EPEC诊断血清分型、bfpA基因PCR扩增以及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析.结果 20株成年人腹泻患者EPEC分离株中,仅1株鉴定为O126血清群；4株儿童腹泻患者分离株中,仅1株鉴定为O26血清群.儿童与成年人腹泻患者EPEC分离株bfpA基因均为阴性.23株EPEC菌株的PFGE带型呈高度多态性,聚类图显示与患者年龄及性别无明显相关.结论 北京市通州区腹泻患者EPEC分离株以非典型为主,单纯通过血清群来诊断EPEC的方法,将会造成极大的漏诊.
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环丙沙星对肠致病性大肠埃希菌转录谱基因表达的影响
目的 探讨不同浓度环丙沙星对肠致病性大肠埃希菌转录基因表达的影响.方法 在肠致病性大肠埃希菌对数生长期加入不同浓度环丙沙星(高浓度组4 μg/ml,低浓度组2 μg/ml),对照组加入生理盐水,分别于0、45、90、135和180 min时收集菌液,提取细菌总RNA,使用表达谱芯片检测环丙沙星作用后肠致病性大肠埃希菌在转录过程中的基因变化,分析各时间点大肠埃希菌转录水平差异;筛选差异基因,采用荧光定量PCR验证差异基因表达.结果 与生理盐水组比较,4 μg/ml环丙沙星组大肠埃希菌共有1 724个基因转录上调,1 806个基因转录下调,2μg/ml组中共有988个基因转录上调,2 297个基因转录下调.在表达差异的基因中,以编码假设合成蛋白及转录调控蛋白基因数多.两组中有共性的基因为21个,这些基因在不同浓度及所有的5个时间点均下调表达,表达的基因包括编码ABC转运膜蛋白基因和菌毛蛋白基因.在2 μg/ml与4μg/ml组的对比中,未观察到环丙沙星影响肠致病性大肠埃希菌致病岛毒力基因的表达差异(P＞0.05).差异表达的基因通过荧光定量PCR检测均有统计学意义(分别与生理盐水组比较,P＜0.05).结论 不同浓度环丙沙星体外对肠致病性大肠埃希菌毒力基因转录的影响无显著性差别,但对耐药相关基因转录具有显著影响,这些影响是否与对肠致病性大肠埃希菌对环丙沙星耐药有关仍需进一步研究.
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EPEC粘附素IntiminC280抗血清的制备及其中和能力测定
目的 制备EPEC粘附素IntiminC280抗血清,检测其中和EPEC对Hep-2细胞粘附作用.方法 用基因克隆技术构建IntiminC280表达载体pET32 (α)-intiminC280,转化表达宿主菌BL21,用IPTG诱导His-IntiminC280融合蛋白的表达,SDS-PAGE分析其表达形式;用NI柱亲和层析法纯化融合蛋白,并辅以佐剂免疫家兔,4次免疫后采血,分离血清,对流免疫电泳法检测抗血清效价;以该抗血清作为一抗,采用Western blot检测EPEC粘附素Intimin的表达;用不同稀释度的抗血清中和EPEC,显微镜下观察细菌被中和后对Hep-2细胞的粘附情况.结果 成功构建BL21/pET32 (α)-intiminC280原核表达系统,表达蛋白的分子质量单位为50 ku,与预期相符.用纯化的His-IntiminC280免疫家兔获得高效价抗血清,16倍稀释后仍能有效抑制EPEC对Hep-2细胞的粘附.结论 IntiminC280抗血清具有抑制是EPEC粘附Hep-2细胞作用,可作为EPEC疫苗研发的备选抗原.
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粪便联合检测致泻病原体在婴幼儿腹泻中的应用
目的 探讨粪便联合检测致泻病原体在婴幼儿腹泻中的应用价值.方法 539份粪便标本同时做细菌培养和3种致泻病原体抗原的检测,肠致病性大肠埃希菌(EPEC)采用分离培养法,对可疑菌株作血清凝集试验,确定血清型;轮状病毒、肠道腺病毒、空肠弯曲杆菌采用乳胶凝集试验测定其抗原.结果 腹泻患儿中轮状病毒检出率达33.0%,空肠弯曲杆菌的检出率7.2%,EPEC的检出率为1.5%,肠道腺病毒的检出率0.7%;检测阳性者的男女比例1.6:1.结论 婴幼儿感染性腹泻的病因主要是轮状病毒和空肠弯曲杆菌,EPEC和肠道腺病毒感染率较低.联合检测致泻病原体对诊断婴幼儿腹泻有应用价值.
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肠致病性大肠埃希菌的直接基因鉴定
目的测定腹泻儿童的肠致病性大肠埃希菌(EPEC)的bfp A和eae A基因鉴定EPEC.方法用聚合酶链反应直接从粪便标本中和传统方法分离后获得的菌株中测定bfp A和eae A基因.结果主要的血清型为O124K72,bfpA和eae A基因存在于血清学凝集的23株EPEC菌株中;直接从粪便标本中和传统方法分离后获得的菌株中测定bfpA和eae A基因的结果有显著性差异(P＜0.01),两种基因的检出率有显著性差异(P＜0.05).结论鉴定EPEC必需同时测定bfp A和eae A基因.
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灭活的双歧杆菌对EPEC的黏附抑制作用
目的:研究灭活的青春双歧杆菌DM8504对肠致病性大肠埃希菌(EPEC)黏附抑制作用.方法:通过与活菌比较,观察灭活的双歧杆菌粘附于人大肠癌CCL-229细胞后对EPEC的黏附抑制作用.结果:用SCS或pH5.0新鲜BS肉汤悬浮的双歧杆菌能够完全抑制EPEC的黏附,而仅用SCS或pH5.0新鲜BS肉汤均不能抑制其黏附.
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一起由肠致病性大肠杆菌引起的食物中毒检验报告
2006年8月18日下午,南通市疾病预防控制中心接报市区某校发生一起疑似食物中毒事件,先后有61名患者出现腹痛、腹泻等症状,少数伴有呕吐.经流行病学调查和临床资料分析,在排除化学性因素后进行微生物检验,结果从患者便样、厨具涂抹液等标本中分离到4株肠致病性大肠埃希菌(EPECO86:K61).现将结果报告如下.
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1株与肠致病性大肠埃希菌O114:K90(B)交叉凝集的阴沟肠杆菌调查
[目的]介绍1株来自食物中毒标本与肠致病性大肠埃希菌多价或单价血清交叉凝集的优势菌,以便供同仁参考.[方法]参照GB/T 4789.4.5.6-2003<食品卫生微生物学检验>检测食物中毒病人的剩余食物、粪便标本.[结果]从1份剩余食物和2份粪便标本中分离出3株优势菌,初步血清学凝集结果均疑为肠致病性大肠埃希菌()114:K90(B),经全面生化反应、微生物鉴定系统分析鉴定为阴沟肠杆菌.[结论]在肠道致病菌的鉴定中,即使是血清学反应符合的菌株也应结合全面生化反应结果分析做出判断.
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肠致病性大肠埃希菌分离株血清型多样性分析
目的 了解不同来源肠致病性大肠埃希菌(EPEC)分离株的血清型.方法 采用特异性PCR方法检测大肠埃希菌不同O抗原编码基因,并以全套O抗血清复核确定O血清群;以PCR扩增和测序H抗原编码基因,经序列比对后确定H型.结果 331株EPEC分离株中,共检测到81种O血清型,其中优势O血清群为O51,占6.0％ (20/331),O145占4.5％(15/331);共检测到25种H型,其中优势H型为H11(8.2％)、H2(7.9％)和H19(7.9％).常见的血清型为O51∶H7和O26∶H11.来自腹泻患者、健康从业人员、动物和生肉类的EPEC分离株中,分别检测到63种、22种、25种和17种O血清群.腹泻患者、动物和生肉类中的优势血清群/型分别为O51(8.7％)、O145(15.7％)和O76∶H7(21.2％),而健康人员的分离株无明显优势血清群.结论 我国EPEC菌株的血清型呈现极大的多样性,无明显的优势血清群(型),传统上依靠血清群(型)对EPEC进行判断的方法存在局限性.
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4种食源性致病菌的多重PCR检测方法的建立
目的:建立一种快速、经济、实用的多重PCR方法,能同时检测4种常见致病菌.方法:根据沙门菌的侵袭蛋白A(invasion protein A,invA)、志贺菌的侵袭性质粒抗原H基因(invasion plasmid antigen,ipaH)、副溶血性弧菌的属特异性基因(thermolabile hemolysin,t1)和肠致病性大肠埃希菌的微绒毛粘连基因(eaeA)分别设计了4对引物,预计PCR扩增的目的片段依次为284、606、450、891 bp.对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、敏感性试验以及优化反应体系,建立了快速检测沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、肠致病性大肠埃希菌的单管多重PCR方法.结果:含沙门菌42 efu/g、志贺菌36 cfu/g、副溶血性弧菌116 cfu/g、肠致病性大肠埃希菌91 cfu/g的肉馅样品经过增菌、DNA提取、扩增、电泳,在16～18 h内应用多重PCR体系能够检出.通过对12株目的菌和15株非目的菌检测,提示该体系特异性高.结论:初步建立能快速、灵敏、特异地检测沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、肠致病性大肠埃希菌的多重PCR体系,可以作为食物中毒病原菌检测的有效方法.
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多重实时荧光PCR检测三种致泻性大肠埃希菌和志贺菌方法的建立
目的:建立一种多重实时荧光PCR同时检测EPEC、EIEC、EHEC三种致泻性大肠埃希菌和志贺菌的方法.方法:于GenBank数据库中查找三种致泻性大肠埃希菌及志贺菌毒力基因stx1、stx2、eaeA及ipaH基因序列并使用软件进行比对后设计四套引物及探针,建立四重实时荧光PCR检测EPEC、EIEC、EHEC和志贺菌的方法,并对方法反应体系及反应条件进行优化,对方法的特异性、敏感性及重复性进行分析.结果:显示该方法具有检测灵敏度高、特异性强,结果与细菌培养结果完全一致,均为100％.结论:四重实时荧光PCR检测体系可同时检测EPEC、EIEC、EHEC和志贺菌,具有快速、特异性强、灵敏度高等特点,可广泛应用于临床检验、卫生检验、食品检验等领域,对快速有效的实施针对治疗,预防食物中毒,保障公众健康具有重大意义.
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肠致病性大肠埃希菌EPECDeng致病岛基因进化特点
目的：分析肠致病性大肠埃希菌（EPEC）致病岛（PAIs）基因进化特点。方法 EPEC Deng 分离自我国婴幼儿腹泻患者粪便标本，鉴定该菌株血清型并进行药敏试验；采用 Illumina 2000仪器对菌株进行全基因序列测序，PHAST 软件定位菌株原噬菌体（prophages，PPs）在染色体中的位置，MUMmer 软件进行共线性分析，构建系统发育树，了解同源基因进化规律。应用 PAI finder 软件对基因组进行 PAIs 预测，了解 PAIs 核心区域（LEE）和核心基因同源进化规律，并进行遗传多态性分析。结果 EPEC Deng 菌株归属 O119∶H6，药敏结果显示该菌株对环丙沙星、左氧氟沙星及氨苄西林耐药，对其余的抗菌药物均敏感。基因组（染色体）序列大小为5025482 bp （GC 含量为50．52％），质粒序列大小为207564 bp（GC 含量为49．50％）。共找到17个 PPs，系统发育树分析发现，EPEC Deng 株基因组与 O26∶H11、O111∶H 同源性较高；EPEC Deng 株 PAIs 和核心基因均与 RDEC-1和O26∶H413／89-1株具有高同源性；遗传多样性分析结果显示，紧密素（eae ）及其受体（tir）多态性丰富，π值均＞0．10，Ⅲ型分泌系统（TTSS）分泌蛋白相对稳定。结论此研究明确了 EPEC Deng 株基因组及 PAIs 的进化特点，有助于了解了本土分离的 EPEC 基因特点。
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肠致病性大肠埃希菌EspB基因的体外诱导表达研究
目的:研究肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli,EPEC) EspB基因的体外诱导表达情况,获得纯化的EspB蛋白.方法:体外构建重组质粒pET-28a-EspB,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒并行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定.重组质粒pET-28a-EspB经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹试验(Western blot)分析.pET-28a-EspB表达产物再次经纯化,获得的纯化蛋白进一步经SDS-PAGE和蛋白质Westernblotting分析验证.结果:经双酶切和测序验证pET-28a-EspB重组质粒构建成功.pET-28a-EspB重组质粒经IPTG诱导后,在诱导表达不同时间点,培养菌液、沉淀和上清中均有良好的蛋白表达.经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证我们获得了纯化的EspB蛋白.结论:体外可成功诱导EPEC EspB蛋白稳定高效表达并获得纯化EspB蛋白产物.
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肠致病性大肠杆菌的生物膜形成对致病岛基因的影响
目的 研究不同pH值条件对肠致病性大肠埃希菌生物膜形成能力及对致病岛基因的影响.方法 将2株EPEC菌株(E11313和E11435)分别接种于pH值为7、9和11的LB培养基,用结晶紫染色半定量法检测2株菌株产生物膜能力,观察产生物膜菌株及非产生物膜菌株生物膜形成的差异,将2株菌株产生的生物膜溶解,提取总RNA,定量PCR检测不同pH浓度的生物膜与致病岛基因EspA表达水平的关系.结果 E11435为生物膜阳性菌株,E11313为生物膜阴性菌株,pH为7～9之间,生物膜的形成变化不大,当pH值=11时,菌株形成生物膜更容易,E11435菌株形成的生物膜可影响EPEC致病岛EspA基因的表达,且当pH=11时,EspA表达水平明显提高(P＜0.05).结论 碱性环境可促进肠致病性大肠杆菌生物膜的形成.生物膜阳性肠致病性大肠杆菌可显著提高致病岛EspA基因的表达水平.
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双歧杆菌表达肠致病性大肠埃希菌EspA蛋白的体外研究
目的 构建肠致病性大肠埃希菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC)EspA蛋白双歧杆菌表达重组菌株,并验证蛋白表达.方法 采用常规PCR扩增EspA片段,体外构建重组质粒pBAD-EspA,转化大肠杆菌BL21感受态细胞培养,挑取单克隆提取质粒,双酶切和PCR对重组质粒鉴定.pBAD-EspA电转化长双歧杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆并PCR鉴定,经木聚糖诱导表达,蛋白质印迹试验(Western blot)分析验证EspA蛋自在双歧杆菌中的表达.结果 经酶切后琼脂糖凝胶电泳及测序结果证明pBAD-EspA重组质粒构建成功.pBAD-EspA重组质粒转化双歧杆菌后经阿拉伯糖诱导,在诱导表达不同时间点菌液沉淀均有良好的蛋白表达.结论 体外成功构建表达EPEC EspA蛋白的长双歧杆菌,为制备ESPA口服疫苗提供科学依据.
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腹泻患者粪便中分离出肠致病性大肠埃希菌
目的 探讨散发腹泻患者粪便中肠致病性大肠埃希菌的分离鉴定.方法 依据GB/T4789.6-2003和WS271-2007对1例腹泻患者粪便标本进行培养分离,经革兰染色镜检、生化试验、血清学试验作出鉴定.结果 从腹泻患者粪便中分离鉴定出肠致病性大肠埃希菌EPEC 0142:K86 (B).结论 导致该患者腹泻的病原菌由肠致病性大肠埃希菌引起.
