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重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建、表达及其对SKOV3细胞克隆形成能力的影响
目的 构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist,为进一步研究上皮性卵巢癌的发生及转移机制奠定基础.方法 生物合成Twist cDNA基因序列,定向克隆至pEGFP-N1表达载体内,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测Twist基因的表达情况;通过克隆形成实验检测pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞的作用.结果 Twist基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞后,Twist基因/蛋白的表达明显上调,转染组较对照组克隆形成明显增加(P＜0.05).结论 成功构建了Twist基因的真核表达载体并能在细胞内稳定表达,Twist基因能增强SKOV3细胞的克隆形成能力.
关键词： 重组质粒 TWIST基因 卵巢癌 真核表达载体pEGFP-N1 基因克隆 -
结核分支杆菌phoS2重组质粒的构建、表达、纯化及生物信息学预测
目的：构建结核分支杆菌 phoS2表达重组质粒、原核表达及纯化重组蛋白,并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法将目的基因亚克隆到 pET32a表达载体,成功构建的重组质粒双酶切鉴定并测序。加 IPTG 诱导表达,表达产物经 SDS-PAGE鉴定后用含 Ni2+的 His-bind树脂柱亲和层析纯化 phoS2,并用 Western blot 对其进行鉴定。应用DNAstar等生物分析软件对该蛋白的理化特性、跨膜区域、二级结构、三维结构进行预测。结果双酶切鉴定及测序分析表明,成功构建了基因工程菌株高效表达质粒 phoS2/pET32a。IPTG诱导表达的 SDS-PAGE鉴定结果显示,上清液中只见极少量的特异蛋白表达带,沉淀部分可见明显的特异表达带,说明 phoS2主要是包涵体表达。经免疫印迹分析获得的 phoS2分子质量为37953 ku。生物信息学预测该蛋白分子质量为37953.1 ku,理论等电点为5.75,具有1个跨膜区,位于1~19位,结构域位于1~370位。结论成功构建了结核分支杆菌 phoS2/pET32a重组质粒,phoS2能够高效表达。蛋白结构功能的预测对本实验的实施及进一步的研究提供了理论依据。
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SIK2 cDNA及其截短体原核表达重组体的构建及表达
目的：构建 SIK2 cDNA及其截短体的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达。方法分别设计 SIK2及其截短体引物,采用PCR方法分别扩增 SIK2、SIK2-Δ1(280~926)、SIK2-Δ2(400~926)、SIK2-Δ3(1~400)、SIK2-Δ4(700~926)五个 cDNA片段,并将扩增的 cDNA片段插入原核表达载体 pGEX-4T-2,构建 GST标签的重组质粒。将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导SIK2、SIK2-Δ1、SIK2-Δ2、SIK2-Δ3和SIK2-Δ4五个截短体的原核表达,用考马斯亮蓝染色和Western blot进行鉴定。结果成功构建了SIK2全长及其截短体cDNA的重组质粒,用考马斯亮蓝染色及 Western blot鉴定显示,SIK2全长及其截短体重组质粒均在大肠杆菌中诱导表达。结论在大肠杆菌中成功地诱导表达了 SIK2重组蛋白及其截短体,为进一步研究 SIK2各结构域的功能提供了实验基础。
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DXS8378基因座等位基因分型标准物的制备及其遗传多态性
目的 采用分子克隆技术制备X染色体DXS8378位点等位基因分型标准物,了解该STR位点在中国云南傈僳、普米、德昂三个群体的遗传多态性及其法医学应用价值.方法 用PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分离各等位基因片段,回收纯化后进行二次扩增,分别插入到pGEM(R)-T Easy质粒载体中,DNA测序证实插入片段的大小和结构,等位基因片段按国际标准进行命名后,经转化、扩大培养、扩增及再鉴定后制备出该位点的等位基因分型标准物,进行群体遗传学研究.结果 得到DXS8378位点分型标准物,应用此分型标准物研究中国云南傈僳、普米、德昂族人群中基因型分布频率.结论 该法制备的STR位点等位基因分型标准物适用于法医学鉴定实践,具有较高的应用价值,适合于群体遗传学的分析.
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重组质粒pEGFP-C1-LRIG1的构建及其在SHG44细胞中的稳定表达
目的 构建含目的 基因多亮氨酸重复区免疫球蛋白样区1(LRIG1)的重组质粒pEGFP-C1-LRIG1,为胶质瘤等多种上皮源性肿瘤的分子治疗奠定基础.方法 采用RT-PCR方法,从人全血总RNA中,扩增出3282bp的LRIG1cDNA片段,再用XhoⅠ和ClaⅠ双酶切后,定向克隆到真核细胞表达载体pEGFP-C1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;免疫细胞化学法检测LRIG1基因的表达情况.结果 人LRIG1基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-C1质粒中;经脂质体转染SHG44细胞后,G418进行筛选,可见转染细胞胞膜上有大量LRIG1蛋白表达.结论 成功构建了pEGFP-C1-LRIG1的真核表达载体,为研究LRIG1基因在胶质瘤等多种上皮源性肿瘤中的作用和其治疗奠定一定的实验基础.
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重组质粒二级结构对丙型肝炎病毒E2蛋白基因表达的影响
将含HCV/E2基因的重组质粒pUC18/HCV-E2的BamHI酶切基因片段和Nco Ⅰ+HindⅢ酶切基因片段分别克隆到原核表达载体pRSETHis中,构建两株重组HCV/E2重组表达质粒pRSET·C/E2和pRSET·A/E2.在诱导表达中pRSET·A/E2的外源基因获得了高效表达,而pRSET·C/E2的外源基因完全未得到表达.
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结核分支杆菌ESAT-6重组蛋白的表达、纯化及临床诊断价值
目的 构建结核分支杆菌6 kDa早期分泌性抗原(ESAT-6)表达质粒,原核表达、纯化,研究其蛋白的免疫学特性和临床诊断价值.方法 将ESAT-6基因与pET28a连接,构建重组质粒;加入诱导剂IPTG进行原核表达,亲和层析法纯化ESAT-6,Western blot法进行免疫学特性鉴定,用间接ELISA法检测结核患者血清中抗ESAT-6抗体.结果 成功构建基因工程菌株高效表达质粒ESAT-6与pET28a以及表达并纯化该重组蛋白.结论 成功构建ESAT-6/pET28a重组质粒,ESAT-6表达量高,纯化的ESAT-6有良好的抗原性.
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结核分支杆菌CFP10/pET32a重组质粒的构建、原核表达及纯化
目的 构建结核分支杆菌重组CFP10/ pET32a表达质粒,原核表达及纯化重组蛋白.方法 将目的基因CFP10亚克隆到pET32a表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3)plysS,鉴定后以IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE检测其表达水平,经含Ni2+的His-bind树脂柱纯化CFP10.结果 菌落PCR鉴定及测序分析表明,成功构建CFP10/ pET32a重组质粒;IPTG诱导表达后,融合蛋白占菌体总蛋白的40%,占裂解物上清总蛋白的72.4%,表明重组的CFP10基因能在BL21中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶性状态存在.结论 成功构建结核分支杆菌CFP10/ pET32a重组质粒,CFP10获得高效表达.
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肝细胞生长因子基因转染促进伤口愈合及预防瘢痕形成的实验研究
肝细胞生长因子(HGF)是一多功能的生长因子,不仅刺激皮肤微血管内皮细胞增殖、运动,而且可促进皮肤角质细胞的迁移运动[1].另外,HGF能够明显地抑制肝纤维性组织中转化生长因子-β(TGF-β)的产生和增强胶原酶的活性[2] .这也提示,应用外源性HGF可能会促进伤口愈合, 抑制胶原的合成和沉积.但直接应用HGF蛋白受到许多限制.为研究人HGF基因预防病理性瘢痕的可行性,笔者构建了携带人HGF基因的重组质粒(pUDKH), 以新西兰兔耳瘢痕为模型,探索其促进伤口愈合、预防创伤愈合过程中瘢痕过度形成的作用.
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脂质体介导血管内皮生长因子基因促进大鼠皮瓣早期断蒂的观察
1材料与方法1.1 重组质粒的制备pcDNA血管内皮生长因子(VEGF)165(华中科技大学同济医学院杨操博士提供)含VEGF165基因片段,位于BamH I和EcoR I 2个酶切位点之间.将其转入大肠杆菌HB101感受态细胞,挑选抗氨苄西林克隆进行小量快速提取,用BamH I和EcoR I双酶切鉴定.同时送北京华大生物公司测序.将保存的大肠杆菌菌种通过碱裂解法提取大量质粒后进一步纯化.质粒经核酸蛋白微量仪(Smart SPECTM型,美国 Bio-Rad公司)检测,定量为12.5μg/μL,以等渗盐水稀释至1μg/μL备用.
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原核质粒pGEX-4T-2-PLEKHQ1及真核质粒pCMV-Myc-PLEKHQ1的构建与蛋白表达
目的：构建基因PLEKHQ1的原核质粒及真核质粒。方法：全长编码基因PLEKHQ1的聚合酶链反应(PCR)产物经EcoRⅠ和Kpn1双酶切后，分别与双酶切后的载体pGEX-4T-2及载体pCMV-Myc相连，在pGEX-4T-2-PLEKHQ1转化E.coli DH5α提取质粒后，转化E.coli BL21中诱导GST-Q1融合蛋白表达，利用谷胱甘肽琼脂糖4B纯化诱导的融合蛋白；而pCMV-Myc-PLEKHQ1则瞬转至293TX细胞；用蛋白质印迹法(Western blot)检测GST-Q1和Myc-Q1融合蛋白表达。结果：将获得的重组质粒进行双酶切鉴定，得到约1500 bp的目的片段，符合预计大小。质粒经测序分析正确后，Western blot检测到诱导及纯化后的GST-Q1和转染293TX后的Myc-Q1蛋白。结论：成功构建的pGEX-4T-2-PLEKHQ1和pCMV-Myc-PLEKHQ1重组质粒，为深入研究PLEKHQ1功能奠定良好的基础。
关键词： 基因PLEKHQ1 pGEX-4T-2载体 pCMV-Myc载体 重组质粒 表达 -
构建原核表达质粒pGEX-4T-2-GFP并鉴定其在大肠杆菌中的表达
目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)的原核表达质粒，用以研究小鼠巨噬细胞吞噬细菌的能力。方法：编码GFP的聚合酶链反应(PCR)产物经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，与双酶切后的载体pGEX-4T-2相连，将pGEX-4T-2-GFP转化E.coli DH5α提取质粒，经测序后转化E.coli BL21中诱导GST-GFP融合蛋白表达，将表达融合蛋白的大肠杆菌滴入培养巨噬细胞的皿中，于荧光显微镜下观察GFP的表达及大肠杆菌被吞噬情况。结果：获得的重组质粒测序正确。荧光显微镜下能清晰观察到培养基中及被巨噬细胞吞噬后发绿色荧光的大肠杆菌。结论：成功构建了pGEX-4T-2-GFP重组质粒，为研究小鼠巨噬细胞吞噬细菌的能力创造条件。
关键词： 绿色荧光蛋白 pGEX-4T-2载体 重组质粒 表达 荧光显微镜 -
慢性粒细胞白血病治疗的新途径--基因免疫诱导CTL杀伤
20世纪90年代初,在传染病及肿瘤治疗史上诞生了一种新的治疗方法--基因免疫(gene immuization),其基本原理是将编码抗原的基因重组质粒直接注射到体内,被体细胞提取并表达出相应的抗原,诱导机体产生特异的CD+8细胞毒性T细胞(CTL)反应,导致分泌该抗原的靶细胞溶解,从而使机体获得保护性免疫而达到彻底治愈肿瘤的目的.基因疫苗是近年来受到人们关注的一种新型疫苗,其刺激机体产生免疫应答的过程类似于病原微生物感染或减毒活疫苗接种,但基因疫苗克服了减毒活疫苗可能反祖并导致人类疾病及病毒发生变异而对新型变异株不起免疫保护作用的缺点,这项新的免疫技术有望成为治疗CML的突破口.
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基于重组质粒制备STR分型阳性参照物
目的 基于重组质粒制备可用于校准法医STR分型的阳性参照物.方法 以常用阳性参照物9948人类基因组DNA STR分型为依据,基于重组质粒构建包含CSF1PO、D7S820、TH01等40个常染色体位点,DYS391、DYS522、DYS385a/b等22个Y染色体位点以及性别判定基因座Amelogenin的STR分型阳性参照物.将重组质粒定量、稀释后等比例混合,分别应用于DNATyper(R) 19、DNATyper(R)24、DNATyper(R)Y、AmpF(R)STR Identifiler(R) Plus以及PowerPlex(R)18D System五种扩增试剂盒.结果 阳性参照物中各重组质粒浓度为0.0 1pg/μL～0.001pg/μL;应用于AmpF￡STR(R) Identifiler(R) Plus PCR扩增试剂盒,基于重组质粒制备的阳性参照物与人类基因组DNA扩增检测结果差异较小;将此阳性参照物分别应用于不同公司、不同STR基因座的四种STR扩增试剂盒,电泳检测图谱显示各基因座基因型完整,分型正确,峰高相当,基因座间均衡性良好.结论 基于重组质粒制备STR分型阳性参照物,是一种可以替代细胞系制备阳性参照物的方法,具有一定的参考价值.基于此方法制备的阳性参照物可适用于市面上常用的STR检验试剂盒,普适性较强,对法医DNA分型检测有一定的实用价值.
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HBOV病毒VP1蛋白的重组表达及在感染检测中的应用
[目的]建立检测HBOV感染的免疫学检测方法和进行儿童人群中感染调查.[方法]采用PCR扩增克隆HBOV病毒VP1核衣壳蛋白部分基因,将其基因克隆至PET32a,构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌中以包涵体形式获得表达.诱导表达后采用凝胶电泳切胶纯化目的蛋白.用重组蛋白作包被抗原建立了间接酶联免疫检测方法.[结果]病人血清及献血员血清均以1:50稀释,经检测北京和深圳的85份标本,阳性6人,阳性率7.06%,而正常献血员150人均为阴性,人群中感染率较低.[结论]成功重组表达了VP1蛋白,建立了检测抗体的ELISA方法.国内存在该病毒感染,被调查的人群中HBOV感染率较低.
