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原核质粒pGEX-4T-2-PLEKHQ1及真核质粒pCMV-Myc-PLEKHQ1的构建与蛋白表达
目的：构建基因PLEKHQ1的原核质粒及真核质粒。方法：全长编码基因PLEKHQ1的聚合酶链反应(PCR)产物经EcoRⅠ和Kpn1双酶切后，分别与双酶切后的载体pGEX-4T-2及载体pCMV-Myc相连，在pGEX-4T-2-PLEKHQ1转化E.coli DH5α提取质粒后，转化E.coli BL21中诱导GST-Q1融合蛋白表达，利用谷胱甘肽琼脂糖4B纯化诱导的融合蛋白；而pCMV-Myc-PLEKHQ1则瞬转至293TX细胞；用蛋白质印迹法(Western blot)检测GST-Q1和Myc-Q1融合蛋白表达。结果：将获得的重组质粒进行双酶切鉴定，得到约1500 bp的目的片段，符合预计大小。质粒经测序分析正确后，Western blot检测到诱导及纯化后的GST-Q1和转染293TX后的Myc-Q1蛋白。结论：成功构建的pGEX-4T-2-PLEKHQ1和pCMV-Myc-PLEKHQ1重组质粒，为深入研究PLEKHQ1功能奠定良好的基础。
关键词： 基因PLEKHQ1 pGEX-4T-2载体 pCMV-Myc载体 重组质粒 表达 -
PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立
目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)永生化细胞系,为全面研究PLEKHQ1基因功能提供细胞实验材料.方法:采用慢病毒感染的方法将猿猴病毒40(SV40)大T抗原基因导入已鉴定出基因型的MEF中,建立永生化细胞系;利用聚合酶链反应(PCR)检测SV40大T抗原基因在MEF中的整合情况,利用反转录PCR及凝胶成像的方法观察SV40大T抗原基因在MEF中的表达.结果:SV40大T抗原基因已整合至MEF中,且此类MEF已扩大培养及稳定传代半年之久.结论:成功建立的PLEKHQ1基因敲除MEF永生化细胞系,可为进一步研究PLEKHQ1基因功能提供细胞实验材料.
关键词： 基因PLEKHQ1 SV40大T抗原基因 慢病毒感染 胚胎成纤维细胞 永生化
