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CCM3基因缺陷对铅所致小鼠胚胎成纤维细胞遗传毒性影响的体外研究
目的 探讨CCM3基因缺陷对醋酸铅所致小鼠胚胎成纤维细胞遗传毒性的影响.方法 将C57雌鼠与CCM3基因敲除小鼠杂合雄鼠合笼后,取孕13.5 d的胎鼠,原代分离培养胚胎成纤维细胞.基因分型后,野生型和CCM3基因缺陷型细胞分别给予6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μmol/L醋酸铅处理,用MTS法检测细胞活性,并根据实验结果,选择6.25、25.00、100.00 μmol/L醋酸铅染毒,用双核阻滞法检测遗传毒性,用Western blot法检测相关基因的蛋白表达情况.结果 小鼠胚胎成纤维细胞经醋酸铅处理24 h后,野生型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(69.16±1.36)与对照组(100.00±2.33)相比,细胞活性下降了30％,杂合型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(87.16±5.50)与对照组(100±2.06)相比,细胞活性下降了13％,差异有统计学意义(F野生型=98.59,F杂合型=82.63,P值均＜0.001).经醋酸铅处理48 h后,野生型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(51.99±5.62)与对照组(100.00±3.11)相比,细胞活性下降了50％,杂合型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(66.33±4.06)与对照组(100.00±5.72)相比,细胞活性下降了35％,差异均有统计学意义(F野生型=82.63,F杂合型=36.86,P值均＜0.001).双核微核实验结果显示,随着染毒剂量增加,两种基因型细胞的核分裂指数逐渐下降,双核细胞微核率呈逐渐升高趋势,野生型细胞对照组、6.25、25.00、100.00 μmol/L剂量组的双核微核细胞率分别为29.6 ±2.2、47.3±6.6、55.5±9.1、66.8±3.5(/1 000);杂合型细胞的双核微核细胞率则分别为35.3 ±5.6、50.0±8.3、57.0±8.5、58.8±2.1(/1000).Western blot结果显示,野生型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(0.70±0.03)的CCM3表达量是对照组(0.53±0.07)的1.32倍,杂合型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(0.48±0.02)的CCM3表达量是对照组(0.27±0.04)的1.77倍,缺陷型细胞升高较多,差异有统计学意义(F野生型=14.77,F杂合型=25.74,P值均＜0.001);野生型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(0.69±0.03)的γ-H2AX表达量是对照组(0.65±0.07)的1.06倍,杂合型细胞100.00 μmol/L醋酸铅处理组(0.99±0.04)的CCM3表达量是对照组(0.64±0.06)的1.55倍,差异有统计学意义(F野生型=7.08,P=0.012;F杂台型=13.49,P=0.002).结论 CCM3基因可能在铅所致小胚胎成纤维细胞的遗传毒性中发挥作用,在小鼠胚胎成纤维细胞毒性方面,铅暴露与CCM3基因存在交互作用.
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人胚胎生殖细胞在人胚胎成纤维细胞饲养层上的生长
目的探讨以人胚胎成纤维细胞为饲养层分离、培养人胚胎生殖细胞的方法和条件.方法分离、培养3～4月胚胎成纤维细胞,取3～15代细胞经丝裂酶素处理后铺板备用;分离6～11周胚胎原始生殖细胞,将其置于人胚胎成纤维细胞饲养层上,在含生长因子、分化抑制因子的培养体系中培养胚胎生殖细胞;用免疫细胞化学方法检测胚胎生殖细胞表面标志SSEA-1和SSEA-4;钙-钴法检测碱性磷酸酶活性;RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达.结果人胚胎成纤维细胞可连续传代25代以上(6月),3～15代细胞可以用作饲养层细胞.分离的胚胎生殖细胞在饲养层上可增殖形成典型胚胎生殖细胞集落,并能连续在体外培养超过8代.集落未分化标志检测显示SSEA-1、SSEA-4呈阳性,碱性磷酸酶活性呈强阳性,Oct-4表达阳性.结论用人胚胎成纤维细胞作为饲养层能获得可连续增殖的胚胎生殖细胞.
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大鼠胚胎成纤维细胞与胰岛共培养的实验研究
目的 探讨大鼠胚胎成纤维细胞(EFCs)与胰岛共培养对胰岛活性与功能的影响.方法 制备SD大鼠胚胎饲养层;分离SD大鼠胰岛.实验分为单纯胰岛培养组、EFCs与胰岛共培养组和EFCs单纯培养组.胰岛活性以AO/PI、DTZ染色、线粒体活性检测,以胰岛素释放试验评价其功能.结果 共培养组中,AO/PI双染显示胰岛活性高于95%,MTT显示共培养3、5、7、14d胰岛细胞吸光度明显高于单纯培养组(P＜0.05或P＜0.01),刺激指数SI也明显高于对照组.结论 新鲜分离的胰岛与EFCs饲养层共培养可明显改善胰岛功能.
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优化建立猪多能性细胞及向神经谱系细胞特异性分化
目的 探讨建立猪多能性细胞(iPPCs)的优化方案,并探求其向神经谱系细胞特异性分化的方法.方法 利用经典的Yamanaka方法,联合应用组蛋白乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)、甲基转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-AZA)及Oct4病毒的重复感染,优化重编程方案,诱导巴马小型猪胚胎成纤维细胞为诱导的iPPCs.通过Real-time PCR检测重编程过程中多能性基因的分子表达.通过维甲酸(RA)及细胞外基质(ECM)的联合培养,诱导iPPCs向神经谱系细胞特异性分化,免疫荧光细胞化学方法检测神经特异性标记物表达.结果 应用优化方案,将猪胚胎成纤维细胞重编程为iPPCs.Real-time PCR显示,VPA和Oct4病毒的重复感染可显著促进重编程过程中多潜能基因的表达.5-AZA未显著提高多潜能基因的表达.RA及ECM的联合培养可诱导iPPCs向神经谱系细胞分化,并表达神经特异性标志基因神经元类型Ⅲβ-微管蛋白(Tuj1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).结论 在利用优化方案建立猪多能性细胞的基础上,将其向神经谱系细胞特异性分化,对人类神经性疾病的细胞替代治疗具有重要意义.
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Cdc20基因突变对 APCmin／＋小鼠胚胎成纤维细胞生长的影响
目的：观察Cdc20AAA/＋APCmin/＋基因型小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的生物学性状，探讨Cdc20基因突变对MEFs生长的影响及机制。方法制作Cdc20AAA/＋APCmin/＋基因型、Cdc20AAA/＋基因型、APCmin/＋基因型和野生型（ WT）小鼠胚胎成纤维细胞，绘制生长曲线、进行平板克隆形成实验，比较各种基因型MEFs生长特性的改变。各种基因型MEFs核型分析染色体个数，并检测有丝分裂姐妹染色单体分离情况及是否存在染色体不稳定。结果Cdc20AAA/＋APCmin/＋基因型MEFs生长速度快于APCmin/＋基因型（P＜0.01）。 Cdc20AAA/＋APCmin/＋基因型MEFs克隆形成能力明显增强。 Cdc20AAA/＋APCmin/＋MEFs 中可见姐妹染色单体的提前分离，且染色体数目异常要多于APCmin/＋MEFs，大多数为38对。结论 Cdc20AAA/＋基因突变促进APCmin/＋小鼠胚胎成纤维细胞生长及增殖，使其呈现肿瘤细胞的生长特性，其机制可能与染色体不稳定有关。
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胚胎成纤维细胞与含LIF的培养体系支持鼠造血祖细胞体外扩增
为了探讨胚胎成纤维细胞与含白血病抑制因子(LIF)的培养体系对鼠骨髓造血祖细胞体外扩增效应,并观察其对造血表面归巢相关黏附分子VLA-4(CD49d)、VLA-5(CD49e)、LFA-1(CD11a)、HCAM(CD44)、L-selectin(CD62L)的表达影响,将丝裂霉素C灭活的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和含LIF的培养体系与鼠骨髓单个核细胞(BMMNC)体外共同培养7天,检测BMMNC细胞总数、CFC、Sca-1+细胞百分率、细胞凋亡率和Sca-1+细胞表面黏附分子CD49d、CD49e、CD11a、CD44、CD62L的表达率.结果表明:MEF和含LIF的培养体系明显扩增了BMMNC细胞总数、CFC和Sca-1+细胞,抑制细胞凋亡(P《0.05),而去掉MEF和LIF后的对照组培养体系BMMNC细胞总数明显下降,CFC和Sca-1+细胞完全死亡,细胞大部分凋亡(P《0.01).扩增后Sca-1+细胞表面各黏附分子CD49d、CD44和CD61L表达与扩增前相当(P《0.05),而CD49e和CD11a表达明显高于扩增前(P《0.05).结论:胚胎成纤维细胞和含LIF的培养体系体不仅可以体外显著扩增鼠骨髓造血祖细胞,而且扩增后的造血祖细胞(HPC)总体上保持其表面归巢相关黏附分子的表达,扩增后HPC归巢功能不受影响.
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昆明小鼠胚胎成纤维细胞培养条件的研究
目的 探讨昆明小鼠胚胎成纤维细胞分离与培养条件.方法 取昆明小鼠胚胎消化分离制备细胞悬液,观察胰蛋白酶浓度、胎龄选择及接种浓度对成纤维细胞质量的影响.结果 采用0.0625%胰蛋白酶分段消化孕13.5～14.5 d胎鼠可制备足量、高活力的细胞悬液,以(30～40)×105/ml接种浓度接种时细胞生长状态较理想.结论 昆明小鼠可分离成纤维细胞,用于滋养层制备.
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葡萄糖调节蛋白在肿瘤细胞中的表达及意义
葡萄糖调节蛋白(glucose regulated proteins,GRP)是细胞为了适应内质网应激状态所产生的一类应激蛋白,与热休克蛋白(heat shock protein, HSP)有较高的同源性.GRP首先发现于1977年,Shiu等发现在无葡萄糖介质中培养鸡胚胎成纤维细胞的过程中可以诱导产生两种相对分子质量分别为78000和94000的蛋白,即命名为GRP78和GRP94.
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小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养
目的 探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离与培养.方法 取BALB/c小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对MEF的生长形态进行观察,并对传代细胞培养液、胚胎胎龄、胰蛋白酶浓度进行筛选.结果 MEF在体外为贴壁生长型细胞,第三、四、五代细胞纯度较高且增殖为旺盛;添加血清的M199和DMEM均能较好的满足原代细胞的生长,两种培养液中细胞增殖的速度无明显差异;11.5～16.5 d胎龄的小鼠胎儿MEF分离效果好;0.1%胰蛋白酶消化MEF时间以8～11 min为宜.结论 通过对MEF分离培养影响因素的筛选,为MEF的进一步研究奠定了基础.
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ICR胎鼠成纤维细胞培养方法的优化
目的 确定胎鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)优制备方法,为MEF的制备节省时间与原材料.方法 取胎鼠组织,采用组织块培养法、胰酶消化培养法、胰酶消后组织块培养法进行分离培养MEF,比较观察MEF纯度、生长速度、细胞形态等指标,筛选节省时间与原料的一种培养方法.结果 组织块培养法所得MEF生长速度慢,细胞体积小,杂细胞少,纯化所需传代次数少.胰酶消化培养法的MEF生长速度快,体积较大,杂细胞数量多,纯化所需传代次数较多.胰酶消化后组织块培养法的消化后组织块的成纤维细胞生长速度介于前两种方法之间,细胞体积和形态与组织块法培养结果相似,杂细胞数量较少,纯化所需传代次数少.结论 胰酶消化结合组织块培养法能大限度的利用材料,在短时间内可制备大量MEF,满足核移植试验与作为饲养层细胞的需求.因此,胰酶消化结合组织块培养法是MEF优培养方法.
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一种高效转染西藏小型猪胚胎成纤维细胞的方法
目的：应用Nucleofector II核转染仪将外源基因EGFP导入西藏小型猪胚胎成纤维细胞（PEFs），并与脂质体转染的方法进行比较，寻求一种高效转染猪胚胎成纤维细胞的方法。方法使用 Lonza 公司的Nucleofector II核转染仪，参考已报道的转染程序与相应的转染试剂，将绿色荧光蛋白（ GFP）基因导入西藏小型猪PEFs，并与脂质体转染的方法进行对比研究，比较两种方法的转染效率。结果转染5 h后，核转染仪组镜下即可见绿色荧光，转染效率高达80％，远远高于脂质体转染的方法。结论用Nucleofector II核转染仪能实现西藏小型猪PEFs的高效转染，为高效制备转基因克隆西藏小型猪提供了可靠的方法。
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CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备
背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为干细胞生长用饲养层,优于无饲养层,它能够分泌一些既促进干细胞生长又能抑制干细胞分化的因子.目的:建立CF-1 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层佳的分离培养方法,分析丝裂霉素C 抑制成纤维细胞增殖的佳浓度与时间,用于培养诱导多能性干细胞.方法:取孕10~15 d CF-1 小鼠,分离胎鼠原代成纤维细胞,经不同质量浓度(5,10,15,20 mg/L)丝裂霉素C 处理不同时间(1,1.5,2,2.5,3 h)制备饲养层,并观察其增殖情况.将人诱导多潜能干细胞或胚胎干细胞在丝裂霉素C 处理过的饲养层上培养,观察细胞集落生长情况.结果与结论:制备CF-1 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的佳胎龄为13.0~14.0 d.丝裂霉素C 抑制CF-1 小鼠胚胎成纤维细胞增殖的佳浓度及作用时间为10 mg/L,2.5 h,成纤维细胞饲养层可以维持5~7 d.诱导多能性干细胞与胚胎干细胞在经10 mg/L 丝裂霉素C 处理2.5 h 后饲养层上能发育成典型的"鸟巢"状干细胞集落.
关键词： 胚胎成纤维细胞 诱导多潜能分化干细胞 饲养层 丝裂霉素C 细胞集落 -
小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G的培养
背景:小鼠胚胎干细胞系SF1-G是由雌性C57BL/6 小鼠与雄性M. spretus 小鼠交配后,取桑葚胚期胚胎在STO饲养层细胞上分离培养获得,STO细胞较昂贵,而由小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层细胞不仅取材容易,而且形成胚胎干胞的克隆率、维持胚胎干细胞正常核型的能力均比STO细胞要好一些,因此,建立一种适宜SF1-G细胞扩增的培养体系,保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提.目的:建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及胚胎干细胞饲养层细胞制备体系;以建立有效的小鼠胚胎干细胞(SF1-G细胞)扩增培养体系.方法:从孕12.5～14.5 d的ICR小鼠分离培养原代小鼠胚胎成纤维细胞;取 3～5 代的小鼠胚胎成纤维细胞,以丝裂霉素C抑制其增殖能力制备饲养层细胞;在饲养层细胞上增殖培养SF1-G细胞;染色体G显带分析法检测SF1-G细胞核型,SF1-G细胞碱性磷酸酶染色和RT-PCR检测Oct4、Nanog基因表达.结果与结论:从孕鼠胚胎有效分离到小鼠胚胎成纤维细胞,以3～5代细胞制备的饲养层细胞能够支持胚胎干细胞SF1-G呈边界清晰的克隆样生长.染色体核型检测 SF1-G保持正常核型,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性.实验建立了有效的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养体系,并制备供胚胎干细胞进行增殖培养饲养层细胞体系,能够在实验室对 SF1-G细胞保持正常未分化状态培养.
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ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备
背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为上述两种细胞提供类似的胚胎发育环境.目的:建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞.方法:使用胰蛋白酶消化法分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察不同的胰蛋白酶水平及消化时间对获取小鼠胚胎成纤维细胞的量及其增殖活性的影响;利用不同质量浓度丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞1,1.5,2,2.5,3,3.5 h制备饲养层细胞,MTT法检测其增殖活性,探索其制备饲养层的佳条件.结果与结论:分离ICR小鼠胚胎原代成纤维细胞佳胰蛋白酶浓度为0.05%,消化时间为12～15 min,丝裂酶素佳作用质量浓度和时间为10 mg/L作用2.5 h,成纤维细胞饲养层可以维持8～12 d.0.05%胰蛋白酶消化15～20 min效果优于0.15%,0.25%胰蛋白酶消化;10 mg/L丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞2.5 h能有效抑制其增殖,表明该条件下的饲养层细胞能很好的支持胚胎干细胞及诱导多能性干细胞生长.
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鼠胚成纤维细胞的培养条件及滋养层制备
背景:鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素C处理或Y射线照射阻断其有丝分裂后,铺层的细胞可保持活力但不增殖,并能够在生长过程中产生促进胚胎十细胞生长的因子和抑制胚胎干细胞分化的因子,但其生命期有限.目的:探讨分离小鼠胚胎成纤维细胞的适胚龄与培养条件,以及用其制备细胞饲养层的效果.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-11/2006-07在广东省计划生育专科医院实验室完成.材料:清洁级昆明系孕7.5,10.5,13.5,16.5,19.5 d雌鼠各5只.方法:无菌取上述各孕龄小鼠胚胎分离鼠胚成纤维细胞,调整细胞浓度为1×107L-1、1×109L-1 1×1011 L-1,胰酶消化传代.当胚胎成纤维细胞生长并相互接触时,加入丝裂霉素C作用2-4 h,用无钙无镁PBS配制的胰蛋白酶液消化2～5 min,终止后用吸管吹打皿底,使细胞充分分离,以含10%胎牛血清的DMEM液调整细胞浓度为5×108 L-1,将该悬液移入明胶处理的培养皿内常规培养,制备鼠胚成纤维细胞饲养层.主要观察指标:胎龄、细胞浓度、传代次数对鼠胚成纤维细胞生长增殖的影响.不同胎龄鼠胚成纤维细胞饲养层制备效果.结果:7.5～19.5 d鼠胚均可分离出成纤维细胞,但7.5 d.10.5 d鼠胚分离所得成纤维细胞数少,寿命短,且混有大量杂细胞:13.5d鼠胚分离所得成纤维细胞数量多,增殖快,所含杂细胞少:16.5～19.5 d鼠胚分离所得成纤维细胞生长状态不良,增殖缓慢,杂细胞较多.同等条件下与1x107 L-1、1×1011 L-1浓度比较,1×109 L-1浓度的鼠胚成纤维细胞生长状况良好,铺层时间适中,细胞寿命长(P＜0.05).以13.5 d鼠胚成纤维细胞经初代培养后传4代,成功建立了成纤维细胞株,相同条件下1～代细胞形态,体积、生长状况无明显差别.7.5～19.5 d鼠胚成纤维细胞制备的饲养层,铺层时间基本相似(P＜0.05),细胞寿命均可维持一二周.结论:分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的适胎龄及细胞浓度分别为13.5d与1×109 L-1,4代以内传代次数不影响鼠胚成纤维细胞的生长增殖,且不同胎龄所制备的饲养层细胞寿命无差别.
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小鼠胰腺干细胞在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下的体外连续传代培养
背景:胰腺干细胞具有分裂与高度分化潜能的特性,可以在体外进行成功分离和培养,但体外如何对其进行有效扩增是亟待解决的问题.目的:在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下体外传代培养小鼠胰腺干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在广西中医学院基础医学院细胞无菌培养室完成.材料:SPF级新生昆明小鼠20只,孕14 d昆明小鼠多只,均购自广西中医学院实验动物中心.方法:取SPF级新生昆明小鼠的胰腺组织,V型胶原酶消化,未消化完全的组织块自然沉降后,收集上层的含细胞离散液,离心弃上清,加入含角质细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清低糖DMEM培养基,在经多聚赖氨酸溶液处理的24孔板中培养.取孕14 d昆明小鼠,剖腹取胎鼠,去除头部及内脏,将躯干及四肢采用组织块胰蛋白酶消化法分离培养成纤维细胞,调整密度为5×108L-1接种于24孔板中,传至第3代经丝裂霉素适当处理制备饲养层细胞.取原代培养5 d的胰腺干细胞,按30个/cm2密度种入铺有饲养层细胞的孔板中,当胰腺干细胞铺满小孔底部面积的80%时继续传代.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态变化,原代培养48 h对细胞进行碱性磷酸酶染色,通过免疫组织化学染色鉴定胰腺干细胞特异分子标志物巢蛋白的表达.分别于传代后2,3,4,5 d检测碱性磷酸酶、巢蛋白和胰十二指肠同源盒基因1的表达.结果:原代培养的来源于胰腺组织的细胞中,可见一些大、圆、单个核的细胞,胞浆折光性强,核浆比例大,呈附壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达胰腺干细胞特异性分子标志巢蛋白,且具有活跃的分裂增殖能力.在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层条件下对胰腺干细胞进行体外传代培养,可连续传至第3代,各代胰腺干细胞仍保持大、圆、单个核、核浆比例大及增殖能力强等特性,传代后各时间点碱性磷酸酶、巢蛋白染色均呈阳性,胰十二指肠同源盒基因1蛋白染色呈阴性反应,可保持未分化状态.结论:以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,经丝裂霉素C处理后可分泌供胰腺干细胞生长所需的因子,并抑制胰腺干细胞的自主分化,体外连续传至第3代仍能够保持较好的生长特性、高度增殖能力及未分化状态.
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小鼠成纤维细胞饲养层的制备及C57BL/6小鼠胚胎干细胞系的建立
目的:制备小鼠成纤维细胞饲养层并建立C57BL/6小鼠胚胎干细胞(ESC)系,为进一步建立人ESC系提供依据.方法:取妊娠12.5～14.5 d的胎鼠,组织消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)；收集C57BL/6小鼠3.5d的囊胚培养于小鼠制作的饲养层上；分离内细胞团(ICM),扩增传代40代以上.观察ESC集落的生长情况.采用碱性磷酸酶(AKP)染色、免疫组织化学早期胚胎特异性表面抗原(SSEA-1)、八聚体结合转录因子4(OCT-4)染色和体内分化实验对ESC集落进行鉴定.结果:分离培养后得到的ESC可稳定传代至40代以上,且均呈集落样生长.经AKP、SSEA-1和OCT-4染色后ESC均呈红褐色阳性表达,接种于裸鼠均可形成畸胎瘤；HE染色,有3个胚层组织成分.结论:成功建立了C57BL/6小鼠ESC系.
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人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜来源的成纤维样细胞作为饲养层体外培养人胚胎生殖细胞方法的建立
目的:研究以来源于人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜的成纤维样细胞为饲养层,体外培养人胚胎生殖细胞(hEG).方法:分离培养孕5～9周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜中的成纤维样细胞,以该细胞作为饲养层,体外原代培养来源于孕5～9周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜组织的hEG.免疫荧光染色法、碱性磷酸酶染色法和体外分化实验用于鉴定所培养的hEG.结果:成功分离培养人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜来源的成纤维样细胞,可传至25代以上,并保持状态稳定,3～15代人胚胎成纤维样细胞用于制备饲养层.21例hEG原代培养中,有7例获得明显增殖的hEG细胞集落,目前传到第10代,仍然保持碱性磷酸酶、胚胎阶段性表面抗原(SSEA)-1、SSEA-4和POU转录因子Octamei-4(Oct-4)的表达为强阳性,并具有向3个胚层细胞分化的能力.结论:成功利用人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜的成纤维样细胞作为饲养层细胞,获得了能够增殖并保持未分化状态和多向分化潜能的hEG,建立了一种新的hEG培养方法,为hEG的体外培养建系奠定基础.
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昆明小鼠胚胎干细胞滋养层制备条件的实验研究
目的:建立小鼠胚胎成纤维细胞(MEFS)滋养层,用于昆明小鼠胚胎干细胞的培养.方法:取妊娠13.5的胎鼠,采用组织消化法分离培养出原代成纤维细胞,对MEFS的生长形态、生长曲线及分裂指数进行观察;MTT法筛选丝裂霉素C(MMC)作用的佳浓度和时间;取妊娠3.5 d的囊胚在经MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞集落生成情况.结果:MEFS为一种贴壁生长且增殖速度较快的细胞,第三代细胞增殖旺盛,第5代以后细胞开始变形并趋于衰老;MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,佳的作用浓度和时间是10ug/ml作用2.5～4h,20ug/ml作用1-2.5h.妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成典型的"鸟巢"状干细胞集落,并可维持胚胎干细胞的正常形态且不发生分化.结论:这种方法制备的滋养细胞层适用于胚胎干细胞的培养.
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小鼠胚胎成纤维细胞制备及小鼠胚胎干细胞E14TG2a的培养
建立稳定有效的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast cells,MEFs)分离培养和制备体系,用于小鼠胚胎干细胞E14TG2a的扩培.从怀孕12.5 d～14.5 d的昆明小鼠分离培养原代MEFs;取P3代的MEFs,使用丝裂霉素C处理以抑制其增殖能力,以此制备小鼠饲养层细胞.在饲养层细胞上扩培E14TG2a细胞.碱性磷酸酶染色以确定细胞是否处于未分化状态;细胞周期检测以观察细胞增殖特性;核型分析检测E14TG2a细胞核型;RT-PCR以检测全能性基因Oct-4和Nanog表达.使用组织消化法可成功分离制备MEFs.制备的滋养层细胞能够支持E14TG2a细胞克隆样生长.碱性磷酸酶检测呈阳性;细胞周期分析结果表明增殖指数为65.83％,传代培养的细胞E14TG2a保持快速增殖特性;核型检测E14TG2a细胞保持正常核型;RT-PCR检测出Oct-4和Nanog基因正常表达.建立了稳定有效的MEFs分离培养和制备体系,用于E14TG2a细胞的扩培.
