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人水甘油通道蛋白9重组质粒的构建及表达
目的:构建人水甘油通道蛋白9(aquaglyceroporin9,AQP9)重组质粒,并检测其融合蛋白在真核细胞COS-7中的表达,为阐明AQP9在非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)中的作用奠定基础.方法:通过RT-PCR方法从人肝脏组织中获得AQP9基因,插入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-N1-AQP9,转染COS-7细胞,通过荧光显微镜检测其转染情况,RT-PCR和Western blot检测AQP9在真核细胞中的表达.结果:PCR及酶切鉴定显示插入人AQP9大小正确.测序鉴定显示,1个碱基发生突变,45位:A→G,为无义突变.通过RT-PCR和Western blot检测到AQP9表达,说明AQP9基因在COS-7细胞中表达并与绿色荧光蛋白融合,且具有免疫原性.结论:成功构建了pEGFP-N1-AQP9重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步研究AQP9在NAFLD发生发展中的作用奠定基础.
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重组AQP9对L-02细胞脂质沉积的影响
目的 构建人水甘油通道蛋白9( aquaglyceroporin9,AQP9)重组质粒,验证其在L-02肝细胞中的表达,并检测其对非酒精性脂肪肝病( nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)细胞模型的作用.方法 从人肝脏组织中提取总RNA,RT-PCR获得AQP9基因,克隆到载体pEGFP-N1上,构建重组质粒pEGFP-N1-AQP9.将其转染L-02细胞,通过荧光显微镜观察其转染情况,RT-PCR和Western blot检测AQP9基因在细胞中的表达.通过油红O染色,测定甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量,检测其对L-02细胞脂肪变性模型的作用.结果 成功构建pEGFP-N1-AQP9重组质粒,并能在L-02细胞中表达,将其转染L-02细胞脂肪变性模型后,油红O染色可见油酸/pEGFP-N1-AQP9转染组较油酸组细胞内脂质含量明显升高,油酸/pEGFP-N1-AQP9转染组细胞内甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量分别为(5.435±0.337)、(2.016±0.144)、(1.485 ±0.113) mmol/L,而油酸组分别为(3.218 ±0.220)、(1.538±0.193)、(1.024±0.148) mmol/L,两者之间差异有统计学意义(P＜0.01),说明上调AQP9表达量可使其脂肪变性程度加重.结论 AQP9异常升高能够引起或加重非酒精性脂肪肝病.
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短发夹RNA干扰胃癌低氧诱导因子-1α表达及其临床意义
目的 探讨RNA T扰对胃癌细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)转录和蛋白表达的作用以及对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建人HIF-1α基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体并转染胄癌细胞BGC-823;采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α mRNA、蛋白表达水平;MTT法检测转染后对胃癌细胞生长的抑制;TUNEL法观察细胞的凋亡情况;流式细胞术分析转染后胃癌细胞的细胞周期和凋亡率.结果 成功构建了pshRNA-HIF-1α1和pshRNA-HIF-1α2重组质粒;转染BGC-823后,与空质粒组相比,pshRNA-HIF-1α1可有效抑制BGC-823细胞HIF-let基因转录和蛋白质表达,抑制率分别可达93.4%和55.7%;MTT法显示转染后细胞生长明显受到抑制;流式细胞术结果表明转染后,其凋亡率明显高于卒质粒绀(P＜0.05),BGC-823细胞增殖活性显著降低,G0～G1期细胞比例明显增加,S期与G2.～M期细胞比例减少;TUNEL法显爪转染后细胞核固缩,核染色质聚集或断裂;体内实验显示,pshRNA-HIF-1α1的抑瘤率为41.75%.结论 体内、外初步实验证实pshRNA-HIF-1α1能有效抑制胃癌细胞BGC-823 HIF-1α基因表达,抑制胃癌细胞增殖,诱导其凋亡.
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空肠弯曲菌Pen:19 peblA基因序列分析及其真核表达重组质粒的构建
目的针对空肠弯曲菌基因组序列为一超变量序列,测序比较空肠弯曲菌Pen:2和Pen:19 peblA基因的同源性,以证实peblA基因的保守性.在此基础上,构建空肠弯曲菌Pen:19 peblA基因真核表达重组质粒.方法以含有Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的同一对引物行PCR反应,获得空肠弯曲菌Pen:2、Pen:8、Pen:19和Pen:21peblA基因DNA片段,测序比较Pen:2和Pen:19 peblA基因的同源性.并选择与格林-巴利综合征为相关的空肠弯曲菌Pen:19 peblA基因PCR产物为目的片段,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),以构建重组质粒.重组质粒经双酶切鉴定、PCR鉴定和测序确认后转染至COS-7细胞,RT-PCR方法检测其瞬时表达.对阳性克隆培养基上清中PEB1蛋白的表达用ELISA分析.结果测序证实空肠弯曲菌Pen:19 peblA基因序列与Pen:2 peblA基因序列一致.采用RT-PCR方法能够从重组质粒转染的COS-7细胞中扩增出与目的基因大小一致的DNA片段.ELISA分析表明PEB1蛋白在COS-7细胞上清中获得表达.结论空肠弯曲菌peblA基因具有良好保守性,以此成功构建的重组质粒能在COS-7细胞中表达,为空肠弯曲菌DNA疫苗的研究奠定了良好的基础.
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人P56蛋白及其各种缺失突变体酵母表达质粒的构建及鉴定
目的构建干扰素诱导蛋白P56及其各种缺失突变体的酵母表达质粒.方法干扰素诱导HT1080,提取mRNA、RT-PCR获取P56全长及各种缺失突变体的cDNA,以酵母表达质粒pCADT7为载体,构建重组质粒.结果诱导的HT1080中抽提出P56的mRNA、RT-PCR扩增出P56全长cDNA片段,大小与预期值一致约1 500 bp,以P56全长cDNA为模板PCR获得P56各种缺失突变体并插入pCADT7;正确构建了各种pGADT7-P56酵母表达重组质粒.这些质粒DNA测序结果与理论值一致.结论P56全长及各种缺失突变体酵母表达质粒的成功构建,为进一步研究P56功能奠定了基础.
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人内皮活化相关新基因eola1的原核表达及鉴定
目的获得内皮高表达脂多糖相关因子1(eola1)表达蛋白并对其进行分析鉴定.方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法从人ECV-304细胞中扩增出eola1基因开放阅读框,构建重组质粒,测序鉴定后转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,裂解细菌抽提蛋白,目的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western免疫印迹鉴定.结果测序鉴定eola1开放阅读框成功插入PET-46-EK/LIC质粒;重组质粒在大肠杆菌中成功表达人eola1蛋白,主要以包涵体形式存在,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子质量约20×103,Western blot验证出目的蛋白特异表达.结论应用原核表达系统能够成功获得目的蛋白,为下一步制备eola1单克隆抗体及基因功能研究打下基础.
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重组质粒pcDNA3.1/C-sis对大鼠FHF的影响
目的 探讨重组质粒peDNA3.1/C-sis导入大鼠对暴发性肝功能衰竭(FHF)的影响.方法 利用流体力学的方法将重组质粒pcDNA3.1/C-sis导入大鼠肝脏,48 h后用内毒素(LPS)+D-半乳糖胺(D-GalN)诱导大鼠FHF;利用荧光定量PCR及蛋白质印迹法(Western blotting)检测C-sis表达;利用苏木精-伊红(HE)染色及测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性检测凋亡;利用Western Blotting检测Bcl-2和Bax的表达变化;计算大鼠24 h观察期内的死亡率.结果 FHF+C-sis质粒组的C-sis mRNA和蛋白表达水平较正常对照组和FHF+空载质粒组明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.01).与正常对照组相比,FHF+林格液注射组和FHF+空载质粒组肝脏细胞凋亡增多;与FHF+空载质粒组相比,FHF+C-sis质粒组肝脏细胞凋亡减少.与正常对照组相比,FHF+林格液注射组大鼠肝脏组织中Caspase-3的表达增多(P＜0.01);与FHF+空载质粒组相比,FHF+C-sis质粒组大鼠肝脏组织中Caspase-3的表达减少(P＜0.05).与正常对照组相比,FHF+林格液注射组大鼠肝脏组织中Bcl-2表达明显减少(P＜0.01),Bax表达明显增多(P＜0.01);而与FHF+空载质粒组相比,FHF+C-sis质粒组大鼠肝脏组织中Bcl-2表达增多(P＜0.05),Bax表达减少(P＜0.05).在24 h观察期内,正常对照组大鼠均存活,FHF+林格液注射组及FHF+空载质粒组大鼠死亡率分别为70.0％和80.0％;而FHF+C-sis质粒组大鼠仅2o.0％死亡.结论 C-sis基因可减弱LPS+ D-GalN诱导的大鼠FHF.
关键词： 原癌基因蛋白质c-sis 重组质粒 大鼠 肝功能衰竭 急性 -
载脂蛋白-J质粒转染大鼠BMSCs及其在靶细胞中的表达
目的 对比pEGFP-N1-apoJ质粒在不同DNA浓度条件下转染骨髓间充质干细胞的转染率,并测定载脂蛋白-J的表达情况.方法 0.8、1.2、1.6、2.0 μg pEGFP-N1-apoJ质粒分别在脂质体的介导下转染大鼠骨髓间充质干细胞,并在荧光显微镜下观察,确定24、48、72 h时转染率,筛选出能获得高转染率的质粒的量.设置pEGFP-N1-apoJ质粒组、空pEGFP-N1质粒组、空白对照组,用蛋白免疫印迹法检测载脂蛋白-J在24、48、72h3个时间点的表达情况.结果 4个不同质粒浓度组转染率分别为:(16.7±1.0)％、(19.7±1.4)％、(30.1±3.6)％、(21.7士5.5)％,比较4个组间转染效率差异有统计学意义(P＜0.05),且1.6 μg pEGFP-N1-apoJ质粒组转率高.通过蛋白免疫印迹法检测后,3个目的蛋白灰度值与内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)灰度值相比较,蛋白质相对表达水平为:pEGFP-N1-apoJ质粒组1.91±0.12,空pEGFP-N1质粒组0.56士0.11,空白对照组0.57±0.17,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 质粒pEGFP-N1-apoJ可在脂质体的介导下转染入大鼠骨髓间充质干细胞,携带载脂蛋白-J基因的靶细胞可表达载脂蛋白-J.
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人乳腺珠蛋白基因真核表达载体的构建及其表达
[目的]构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.[方法]利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM.将重组载体用脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达.[结果]成功扩增hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达.[结论]hMAM基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据.
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结核杆菌MTC28基因真核表达载体的构建及鉴定
[目的]对结核杆菌MTC28基因进行克隆,构建真核表达质粒并加以鉴定.[方法]采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增带信号肽MTC28目的基因,经NheI和EcoRI消化后,与PCDNA3.1(+)载体进行连接重组.[结果]PCDNA3.1(+)-MTC28真核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定,证实其构建成功.[结论]PCDNA3.1(+)-MTC28真核表达质粒的成功构建,为进一步研究该质粒的免疫保护效果,了解信号肽序列在MTC28蛋白表达和分泌过程中所起的作用及制备相应的结核病DNA疫苗奠定了基础.
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淋病奈瑟菌标准株外膜蛋白NspA基因重组质粒构建和生物信息分析
[目的]研究淋病奈瑟菌标准株(NG 29403和NG 29400)外膜蛋白NspA基因和NspA融合蛋白结构特点,为淋病奈瑟菌疫苗靶蛋白的选择提供依据.[方法]PCR扩增淋病奈瑟菌标准株NG 29400和NG 29403 NspA基因,与表达质粒ET-30c(g+)构建重组子NspA-pET-30c(+),阳性克隆子经双酶切鉴定后进行基因测序.以生物软件对NspA基因进行生物信息分析,并在缦预测其蛋白质结构.[结果]成功构建NspA-pET-30c(+)重组质粒,双酶切获得0.5 kb和5.4 kb预期产物.基因序列分析表明淋病奈瑟菌NspA基因有较高同源性,两标准株与GenBank已有序列均有98%同源性,且与脑膜炎奈瑟菌NspA基因高度近似.蛋白预测显示NspA融合蛋白有40%以上为环状结构,可能为主要功能区.三级结构与脑膜炎奈瑟菌NspA相似.[结论]淋病奈瑟菌NspA基因具有高度保守性,与脑膜炎奈瑟菌NspA基因同源性高,蛋白结构相似,有望成为淋病奈瑟菌疫苗的候选抗原.
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铜绿假单胞菌外毒素A原核表达载体的构建及鉴定
[目的]对铜绿假单胞菌外毒素A (PEA)全基因进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定.[方法]从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,设计PCR引物扩增出带信号肽的PEA目的基因,经Hind Ⅲ和EcoRⅠ消化后,与PET-32a载体进行连接重组.[结果]PET-32a-PEA原核表达质粒构建完成后.用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定,证实其构建成功.[结论]PET-32a-PEA原核表达质粒的成功构建,为进一步研究出有效的基因工程疫苗和用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础.
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临床淋病奈瑟菌外膜蛋白PⅠ基因重组质粒的构建与生物信息分析
[目的]研究淋病奈瑟菌临床分离株外膜蛋白PⅠ基因的结构特点和变异情况,为淋球菌疫苗靶位点的选取提供参考. [方法]提取9株成都地区临床分离淋球菌的基因组,PCR扩增PⅠ基因,与表达载体pET-30b(+)构建重组质粒pET-30b(+)-PⅠ,重组子经双酶切鉴定后测序,利用一系列生物软件对序列进行生物信息学分析. [结果]重组子经双酶切后,在5400 bp和900 bp左右分别得到条带,与预期片断的大小相符合;备PⅠ序列在GeneBank中均搜索到相似性大于98.9%的相似序列,根据碱基数目及序列同源性比较结果,4条属于PⅠA亚型,5条属于PⅠB亚型;PⅠA亚型较PⅠB亚型(除2-7外)含有相对较高的α-螺旋和β-折叠结构,具有单一筒状的三级结构,而PⅠB亚型含有相对较高的环或其他结构,其中的7-2具有相连接的两筒状结构. [结论]成功构建9个pET-30b(+)-PⅠ重组子;PⅠA和PⅠB两亚型核苷酸数目、对应蛋白的二级结构和三级结构均有差异,两亚型内各核苷酸和氨基酸序列的变异程度也不同,本研究结果将为PⅠ蛋白抗原靶位的筛选提供参考.
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狂犬病毒糖蛋白主要免疫活性位点的质粒载体构建
目的:为进一步研究狂犬病毒糖蛋白(G蛋白)免疫活性位点的免疫特性,构建其大肠杆菌重组质粒载体.方法:参考有关文献及用蛋白质亲疏水性分析程序分析,确定目的基因片段,并用分子克隆的方法将目的基因片段插入载体质粒,后测定其核酸序列.结果:在大肠杆菌质粒PUC18的多克隆位点EcoRⅠ和BamHⅠ之间,根据其阅读框架,插入了人工合成的目的基因片段,其含有狂犬病毒G蛋白免疫活性位点GⅡ表位第149～160位氨基酸残基及GⅢ表位第331～340位氨基酸残基所对应的核酸序列.结论:本研究构建了狂犬病毒G蛋白两个主要免疫活性位点的重组质粒载体,为深入研究其免疫活性位点的免疫特性及基因免疫打下基础.
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乙肝病毒共价闭合环状DNA标准品制备及鉴定
目的 通过构建乙肝病毒(HBV)重组质粒来制备共价闭合环状DNA(cccDNA),为cccDNA定量检测提供合适的标准品.方法 选择本院就诊的2名慢性乙肝患者,采取蛋白酶K消化法提取其血清病毒DNA,运用高保真聚合酶扩增HBV DNA,然后将扩增片段插入克隆载体构建HBV重组质粒.以重组质粒为模板制备环状DNA,经测序鉴定和PCR定量检测.结果 HBV DNA全长序列被成功扩增,并顺利构建重组质粒.2个重组质粒经内切酶消化均能得到预期的HBV DNA片段(约3.2 kb)和载体DNA片段(约2.7 kb);经测序鉴定,2个质粒分别为HBV B和C基因型,其插入序列保真性好,错配率低,每kb分别为1.24 bp和1.56 bp;以重组质粒为模板制备的2个环状DNA长度均约为2.1 kb,测序证实为HBV cccDNA;经定量检测,其纯度高,浓度分别为1.05×1010 IU/ml和6.19 × 109 IU/ml.结论 利用重组质粒方式制备的HBV cccDNA具有纯度高、获取量大等优点,可作为cccDNA定量检测和方法性能验证的标准品.
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犬腺病毒DNA疫苗的免疫实验研究
目的 研究犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop刺激机体产生免疫应答的效果.方法 采用2种不同的免疫途径和免疫方案免疫Balh/c小鼠;免疫后每周断尾采血,分离血清测定血清IgG抗体效价;采用MTT和CCK-8方法检测免疫小鼠的T淋巴细胞增殖活性,EIA试剂盒测定IFN-γ的浓度.结果 所有接种DNA疫苗的小鼠均产生了针对抗原病毒的特异性IgG抗体.细胞学试验提示构建的犬腺病毒DNA疫苗也可诱导小鼠产生细胞性免疫应答,重组质粒-蛋白联合的免疫方案在刺激机体细胞免疫应答方面优于单一重组质粒.结论 以上结果提示犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop既能诱导小鼠产生特异性的体液免疫应答,也诱导小鼠产生了细胞免疫应答,对于机体具有一定的免疫保护效果.
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HLA-DRA基因逆转录病毒载体重组质粒的构建和包装
用逆转录病毒载体将HLA-DRA基因转染供体组织,使供受体之间的HLA-DR抗原表型趋于一致形成嵌合体,可能诱导免疫耐受,从而减缓受者免疫活性细胞对移植物的识别和攻击,延长移植物存活时间.本文采用新一代逆转录病毒载体连接HLA-DRA基因,构建pDOR/HLA-DRA逆转录重组质粒,经Lipofectin法包装双嗜性PA317细胞,获得高滴度感染性病毒上清,为进一步开展移植耐受研究提供了重要的实验基础.
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MMP-13基因真核表达载体的构建及其功能研究
为了研究MMP-13蛋白在瘢痕形成的作用,我们构建MMP-13基因真核重组表达质粒,检测并鉴定了MMP-13基因在转染了重组质粒的皮肤角质形成细胞HaCat中的表达.通过RT-PCR方法将MMP-13基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建其真核表达重组质粒pcDNA3.1 (+)/MMP-13,基因测序鉴定.重组质粒以阳离子脂质体2000介导转染HaCat细胞,RT-PCR检测外源基因的表达,间接免疫荧光和Western blot检测外源蛋白的表达.以明胶酶谱法和MTT法分别检测MMP-13的活性以及其对HaCat细胞增殖的影响.通过RT-PCR检测到MMP-13基因在重组质粒转染后的HaCat细胞中大量表达,以间接免疫荧光反应和Western blot可检测到MMP-13蛋白在在重组质粒转染后的HaCat细胞中呈阳性,明胶酶谱法和MTT法检测显示真核表达质粒pcDNA3.1 (+)/MMP-13表达的MMP-13蛋白具有活性,并且可以抑制HaCat细胞的增殖.构建的重组质粒pcDNA3.1(+)/MMP-13能在Hacat细胞中表达活性蛋白MMP-13,并可以抑制HaCat细胞的增殖,这为研究MMP-13在瘢痕形成中的作用奠定了基础,从而为瘢痕治疗提供有效靶标.
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人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答
探索人β防御素2(hBD-2)和前列腺特异性膜抗原(PS-MA)共表达重组核酸疫苗对前列腺癌的免疫治疗.研究以pcDNA3.1为载体,构建重组质粒pcDNA3.1/PSMA和pcDNA3.1/hBD-2-PSMA,通过RT-PCR和免疫组化检测其表达.并免疫小鼠,进行血清中抗体检测,CD4+、CD8+T淋巴细胞数目测定及CTL特异性杀伤作用检测.结果显示构建的质粒转染COS-7细胞后能表达目的基因,免疫小鼠后能在体内持久表达,可以诱导产生特异性抗体,能有效的刺激T细胞增生,诱导特异性CTL反应.当以hBD-2作为免疫佐剂时,CTL活性增强.本研究成功的构建了含PSMA的表达质粒,免疫小鼠可以诱导出有效的体液和细胞免疫,为前列腺癌的免疫治疗奠定了一定的实验基础.
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利用RTS500系统进行抗菌肽葛佬素蛋白的体外表达
目的:构建含目的基因葛佬素(Gloverin)的重组子并通过体外快速翻译系统RTS500(Rapid Translation System)对其进行表达.方法:采用PCR方法扩增gloverin cDNA,将其与表达载体pIVEX2.3连接;采用PCR及双酶切方法鉴定连接产物.将含目的基因片段的阳性重组质粒通过体外表达翻译系统RTS500,使其蛋白能在大肠杆菌(E. coli)裂解产物中进行表达.
