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大鼠β-防御素-2基因气道转染增强肺抗感染防御功能的研究
β-防御素体外试验显示具广谱抗菌活性,本研究应用转基因方法评估其体内抗菌作用.构建大鼠β-防御素-2(rBD2)重组质粒pBK-CMV-rBD2和pCDNA-3.1-Myc-His(+)-rBD2,通过脂质体包裹的方法将重组质粒经气管滴入,检测其在气管和肺组织表达情况,并应用肺组织匀浆上清菌落计数法检察对绿脓杆菌的肺清除率.结果显示在基因转染大鼠的气管和肺组织内均检测到rBD2-His融合蛋白基因mRNA和蛋白的表达,说明脂质体包裹的重组β-防御素-2 pBK-CMV-rBD2质粒可有效转染气道上皮组织.肺细菌清除率实验显示构建重组质粒pBK-CMV-rBD2气道转染与对照相比可显著提高肺组织对绿脓杆菌的清除率(n=8,p<0.01).本研究表明β-防御素基因气道转染可提高呼吸道天然抗感染防御功能,可能在呼吸道感染的防治实践中具有潜在应用价值.
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转染T-bet基因的人胃癌SGC-7901细胞分泌IFN-γ的作用
采用基因克隆与腺相关病毒包装技术,构建人Th1细胞特异性转录因子T-bet 基因的腺相关病毒载体,并转染入胃癌细胞系SGC-7901细胞.检测转染细胞IFN-γ的分泌功能及其对SGC-7901细胞生物学作用的影响.结果:(1)获得含有T-bet基因的重组腺相关病毒(rAAV-eGFP-T-bet);(2)用rAAV-eGFP-T-bet感染SGC-7901细胞后,约30%～40%的细胞出现绿色荧光.对被感染细胞进行RT-PCR,扩增出1 670bp的T-bet,并经Western blot证实;(3)转染后的细胞测得388 bp的IFN-γ目的条带和IFN-γ蛋白的表达.由此表明,人T-bet基因的腺相关病毒载体rAAV-eGFP-T-bet,可成功转染SGC-7901,并致使转染细胞分泌IFN-γ.为进一步开展T-bet基因干预治疗肿瘤的研究奠定了基础.
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pVAX1-microdystrophin重组质粒的构建及其治疗Duchenne型肌营养不良症的初步研究
目的 构建含有人microdystrophin基因的重组质粒,体内、外研究其表达,为进一步应用此重组质粒来研究电转、静脉、动脉注射或加入其它基因来增强microdystrophin基因的表达等方法对Duchenne型肌营养不良(Duchenile muscular dystrohy,DMD)进行基因治疗奠定基础.方法 用Not Ⅰ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因.片段回收后定向插入真核表达质粒pVAX1,获得重组质粒pAMICDYS.然后将重组质粒pAMICDYS转染小鼠成纤维细胞3T3细胞,通过逆转录-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达;后将重组质粒pAMICDYS通过肌肉注射到DMD模型鼠胫前肌中,检测治疗肌肉的病理变化和microdystrophin的表达情况.结果 成功构建了含有microdystrophin基因的重组质粒,并在体外得到了很好表达,体内研究表明microdystrophin基因在mdx鼠TA也有一定程度的表达,而且减少了所治疗肌肉的核中移数量,证实了其对mdx鼠有一定的治疗作用.结论 该重组质粒的构建及体内、外得到成功表达,为下一步用该质粒进行电转、静脉、动脉注射或加入其它基因来增强microdystrophin基因的表达来治疗DMD疾病奠定了基础.
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杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建
目的 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin.方法 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin.结果 扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确.结论 成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin.
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人血栓调节蛋白基因编码片段的克隆及在真核细胞中的表达
目的构建人血栓调节蛋白(hTM)基因真核表达质粒,并导入两种真核细胞[非洲绿猴肾母细胞(COS-7细胞)和脐静脉内皮细胞(HUVECs)]中表达,为临床血栓病的基因治疗提供实验依据和物质基础.方法采用PCR法扩增hTM基因的表达片段,HindⅢ+EcoRⅠ酶切后与pcDNA3.1(+)/neo质粒连接成pcDNA3.1/hTM.经鉴定确认后,由阳离子脂质体包裹转染COS-7细胞及HUVECs,RT-PCR和免疫组化法分别检测转染后细胞hTM的mRNA及蛋白的表达.结果双酶切及测序鉴定均证实hTM基因表达片段被成功克隆,pcDNA3.1/hTM经脂质体介导能有效地转染COS-7细胞和HUVECVs.结论成功构建pcDNA3.1/hTM重组质粒,并且能在两种真核细胞中高效表达,为进一步的基因治疗和对TM抗凝机理研究提供了物质基础.
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重组端粒酶pEGFP-hTRT质粒的构建
目的构建具有绿色荧光蛋白报道(GFP)基因的端粒酶真核质粒载体,为转染细胞、延长细胞寿命提供基础. 方法酶切含人端粒酶逆转录酶(hTRT)基因的pGRN 145质粒获取hTRT片段,插入经酶切及磷酸化处理的GFP载体pEGFP-C1,形成8.1 kb质粒,经HindⅢ、 NotⅠ酶切电泳筛选、鉴定并测序. 结果经酶切电泳分析得到3.4 kb及4.7 kb大小的两片段;测序结果显示接头两端序列正确. 结论重组端粒酶pEGFP-hTRT质粒的成功构建,可用于细胞转染,对进一步研究组织工程种子细胞的衰老问题具有重要意义.
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Periostin在小细胞肺癌中的表达及其对化疗耐药性的影响
目的 检测 Periostin 在人小细胞肺癌(SCLC)细胞株及临床组织标本中的表达差异,探究其对 SCLC 患者化疗耐药性的影响.方法 通过检测 Periostin mRNA 及蛋白在人 SCLC H69 与 H69AR 中的表达差异,借助 Periostin 重组质粒转染上调 H69 细胞中 Periostin 的表达,比较转染后的 H69 细胞在不同浓度的化疗药物 (顺铂,依托泊苷)中的存活率与空载对照组的差异.检测临床 SCLC 化疗敏感和耐药患者病理标本的 Periostin免疫组织化学结果.结果 Periostin 在 H69AR 内的 mRNA 表达水平显著高于 H69(1.49±0.21 vs. 0.81±0.11, P<0.05),Periostin 蛋白在 H69AR 内的表达水平显著高于 H69(3.29±0.41 vs. 1.34±0.20,P<0.05).Periostin 重组质粒转染 H69 细胞后,在相同浓度的化疗药物(顺铂,依托泊苷)中存活率显著提高,处理主效应(P<0.05).临床 SCLC 组织标本中 Periostin 阳性表达率为 67.44％,而且化疗敏感组低于耐药组(13/24 vs. 16/19,χ2=4.359, P=0.037).结论 Periostin 在 SCLC 细胞敏感株 H69 中的表达明显低于耐药株 H69AR,Periostin 在 SCLC 组织中过表达可增强化疗耐药性,还需进一步研究其机制.
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人釉原蛋白编码区基因真核表达载体PsecTaq2A-AMG的构建
目的构建人釉原蛋白(AMG)编码区基因真核表达载体PsecTaq2A-AMG.方法采用PCR技术体外扩增AMG完整分泌肽编码区.将扩增产物与PsecTaq2A分别用BamH I和Xhol I行双酶切,将获取的AMG目的基因片段连接到双酶切后的PsecTaq2A,构建重组质粒PsecTaq2A-AMG,并对重组质粒进行鉴定.结果①PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,可见大小约519 bp的特异性条带,与预期结果一致.②重组克隆PsecTaq2A-AMG酶谱分析与预期结果一致,序列测定结果与GenBank中的人釉原蛋白序列完全一致.结论用此方法可成功构建AMG编码区基因真核表达载体PsecTaq2A-AMG.
关键词： 人釉原蛋白 重组质粒 PsecTaq2A-AMG -
人源S100A8重组质粒的构建及其对他莫昔芬治疗乳腺癌的影响
目的 构建人源S1000A8的重组质粒,并在人乳腺癌细胞MCF7中表达,初步探索其对他莫昔芬处理下MCF7细胞的影响.方法 设计合成针对人源S100A8基因cds区的引物序列,采用PCR的方法以人乳腺癌细胞MCF7的cDNA为模板,扩增目的基因S100A8,经过NdeⅠ和BamHⅠ双酶切后,克隆至pCMV5-myc质粒上.通过脂质体转染至MCF7细胞中,应用Western Blot法检测其蛋白表达.脂质体转染S100A8至MCF7细胞并应用他莫昔芬处理后,用MTT法检测其细胞活力,Western Blot法检测相关蛋白表达.结果 酶切鉴定证明S100A8基因重组质粒构建成功,并且可以在MCF7细胞中过表达.MTT法显示S100A8可以部分逆转他莫昔芬所造成的细胞活力下降,部分抗凋亡分子表达上升.结论 人源S100A8基因的重组质粒构建成功,为进一步研究S100A8在乳腺癌对他莫昔芬发生耐药的过程中的作用奠定了基础.
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金属硫蛋白2A重组质粒的构建及其在血管内皮细胞中的表达
目的 建立人血管内皮细胞金属硫蛋白2A(MT2A)上调表达细胞模型.方法 构建重组质粒pEGFP-N1-MT2A,转染至人脐静脉内皮细胞(HUVECs),荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR及蛋白印迹法测定细胞MT2A表达水平.结果 测序证实pEGFP-N1-MT2A重组质粒构建正确,转染至HUVECs后,通过RT-PCR蛋白印迹实验证实细胞MT2A表达水平升高.结论 成功构建了重组质粒pEGFP-N1-MT2A,转染至HUVECs可使MT2A表达水平升高.
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VEGF-C真核表达质粒的构建及其真核表达
目的研究人血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因功能片段的表达功能及表达活性.方法以前期从人舌癌克隆得到的VEGF-C功能片段cDNA和真核表达质粒pcDNA3.1(+)构建重组质粒,以阳离子脂质体转染法将其导入舌鳞癌细胞Tca8113,并检测其表达、分泌功能及体外激活能力.结果通过将长度约为1100 bp的VEGF-C功能片段插入pcDNA3.1(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,成功构建出pcDNA3.1(+)-VEGF-C重组质粒,该质粒转染Tca8113细胞后得到VEGF-C高表达的舌癌细胞VcTca,转染后的细胞可表达相对分子质量为53×103和29×103的VEGF-C分子,在细胞培养液中可检测到相对分子质量为29×103的VEGF-C片断.结论构建的VEGF-C重组质粒可在真核细胞实现表达,并能被分泌和激活.
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D7S817、D10S1432、D10S1213及D18S865分型标准物的制备及其遗传多态性研究
目的利用重组质粒制备四个新的STR基因座(D7S817、D10S1432、D10S1213及D1 8S865)的分型标准物,并进行群体遗传学研究. 方法从聚丙烯酰胺凝胶中分离出经PCR扩增后的等位基因片段,二次扩增后纯化的等位基因片段被分别插入到PUC质粒载体中.利用D NA测序证实插入片段大小及结构的正确性后,用国际标准将插入的等位基因片段进行命名. 再转染到适当的E.coli DH5αTM细胞内选择培养,以纯化质粒为模板,扩增出各基因座的等位基因片段后混合.结果得到四个STR基因座(D7S817、D10S1432、D10 S1213及D18S865)分型标准物,应用所制备的分型标准物研究汉族和东乡族群体中的基因型分布频率.结论制备出的四个STR基因座的分型标准物在法科学领域中有很高的应用价值 ,非常适合于群体遗传学的分析.
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变形链球菌重组质粒pcDNA3-pacA/pcDNA3-pacP免疫定菌鼠的龋齿记分研究
目的观察已构建的基因重组质粒pcDNA3-pacA和pcDNA3-pacP作为防龋疫苗的防龋效果.方法分别将基因重组质粒pcDNA3-pacA、pcDNA3-pacP和pcDNA3-pacA+pcDNA3-pacP联合使用作为基因疫苗注入免疫定菌鼠颌下腺区皮下,以Keyes龋齿计分法评估免疫后定菌鼠磨牙的患龋情况.结果重组质粒单独免疫组和联合免疫组大鼠的龋齿计分均明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);联合免疫组和pcDNA3-pacA组的龋齿记分均明显低于pcDNA3-pacP组(P<0.05).结论重组基因质粒pcDNA3-pacA和pcDNA3-pacP均可有效的控制龋损的发生,降低龋坏程度,有望成为防龋基因疫苗.
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莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的DNA序列分析及其在大肠杆菌中的诱导表达
目的为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法采用377型DNA自动测序仪对莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的插入片段进行DNA序列测定，并通过计算机软件对其进行限制性内切酶酶谱分析。然后将重组质粒pBX1在大肠杆菌中进行诱导表达，并对其表达产物进行免疫印迹分析。结果①重组质粒pBX1插入片段大小为477bp，其核苷酸序列与文献报道的p83基因全序列相应区段相比较仅有一个碱基的变异，②成功绘制了该插入片段的限制性内切酶酶谱；③重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后获得了29kd的融合蛋白；④Western-blotting分析表明该融合蛋白能与莱姆病多价抗血清呈强阳性印迹反应。结论该研究成功地对莱姆病螺旋体83kd抗原蛋白特异性区段进行了基因重组和表达，为进一步研究其在莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制中的应用奠定了基础。
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赖型钩体pDC38核酸序列测定及其与流感伤寒型钩体外膜蛋白基因ompL1核酸序列的类似性匹配
为了探讨赖型钩体pDC38插入片段基因组DNA编码、位置与ompL1基因的关系,作者采用在流感伤寒型钩体外膜蛋白基因ompL1首尾区段设计一对引物,以pDC38插入片段作模板进行PCR扩增、测定和类似性匹配(alignment).结果发现:pDC38含有2.7kb和3.0kb两个插入片段,3.0kb片段含有1个ompL1基因全拷贝.结论:类似性匹配表明,pDC38和ompL1相同碱基864个(90%),碱基变异(不配对)96(10%)个, pDC38可用于钩体诊断、分类、鉴定、疫苗和发病机理的研究.
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病毒性肝炎核酸疫苗研究的现状与问题
核酸疫苗又称DNA疫苗，是指将含有编码某种目的抗原蛋白基因序列的真核细胞表达质粒作为疫苗，直接接种机体，在体内合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，达到免疫的目的。乙肝DNA疫苗的抗原基因片段，主要是编码表面抗原的S区，也可包括pre S１、pre S２区。此外，Geissler等〔1〕将包含preS１、preS２的S区基因以及HBcAg编码基因的重组质粒接种小鼠，诱导产生了高滴度抗－HBs及抗－HBc。93%的小鼠产生了强烈的对病毒蛋白的CD４＋T细胞介导的体液免疫的CD８＋T细胞介导的CTL效应。实验表明，DNA疫苗能够产生广泛的CTL效应和强烈的Th细胞反应，伴有Th1细胞因子产生。丙肝DNA疫苗主要是采用C区、E１、E２区、NS３、NS４、NS５区。Hitomi等〔2〕用丙型肝炎病毒(HCV)Ia型的C区基因和少量5＇－非编码区(5＇－NC)和包膜区(E)基因置入含有CMV启动子和增强子下，构建了pHCVC重组质粒。接种到小鼠肌肉细胞，pHCVC在小鼠肌细胞中表达，并产生相应抗体。Cho等〔3〕构建了质粒pTV－NS345和一双顺反子表达质粒pTV－NS345/GM－CSF，前者编码HCVNS３、NS４和NS５蛋白，后者能独立表达HCVNS345蛋白和GM－CSF。给Buffalo小鼠肌肉接种质粒pTV－NS345，对每种蛋白均产生了抗体和T细胞增生反应。若GM—CSF与HCVNS345一起表达，则显著增加T细胞的增生反应。特别是接种双顺反子表达质粒，产生的T细胞增生反应比用两种单独的表达质粒共同注射更为强烈。上述结果表明，共同使用GM—CSF增强HCV NS345特异性的细胞免疫，免疫增强的程度同GM—CSF基因的使用方式而异。
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pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒的构建
目的构建 pEGFP-N1-UCH-L1重组质粒，并进行鉴定。方法提取 Wistar 乳鼠大脑组织总 RNA，逆转录合成cDNA，经 PCR 扩增 UCH-L1基因，定向克隆至载体 pEGFP-N1，构建重组质粒，经测序进行鉴定。结果 UCH-L1基因重组质粒经测序鉴定证明构建正确。结论成功构建了 UCH-L1基因重组质粒，可用于神经细胞转染，进行后续研究。
关键词： 泛素羧基末端水解酶 L1 pEGFP-N1载体 重组质粒 -
靶向mdr1基因转录小发夹RNA重组质粒的构建和序列分析
目的构建针对多药耐药基因(mdrl)编码区的发夹状RNA重组质粒载体pshRNA-mdrl,并行序列分析,为下一步逆转肿瘤的多药耐药性打下基础.方法设计含19-21bp mdr1编码基因片段及中间以4个bp间隔的反向重复序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pTZU6+1上,转化JM109菌株,提取重组质粒酶切鉴定并序列分析.结果将合成的DNA片段成功克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列.结论靶向mdrl基因发夹状RNA干扰重组质粒的成功构建,可进一步研究其对mdr1 mRNA转录的抑制,达到逆转肿瘤的多药耐药性的目的.
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弓形虫三种不同毒株pMD-18-T/GRA1重组质粒的构建
目的 构建弓形虫三种不同毒株TMD-18-T/GRA1重组质粒.方法 从接种了弓形虫三种不同毒株RH株、桂弓株、B36株的小鼠腹水中收集纯化虫体,提取基因组DNA.应用PCR技术,分别扩增出三个不同虫株的致密颗粒蛋白1(GRA1)目的基因片段.将此目的基因片段插入PCR产物克隆专用载体pMD-18-T中,转化大肠埃希菌JM109,PCR鉴定其准确性.结果 获得弓形虫三种不同毒株GRA1目的基因片段为785 bp.构建了pMD-18-T/GRA1重组质粒,经鉴定与预期理论值相符.结论 成功构建了弓形虫三种不同毒株pMD-18-T/GRA1重组质粒.进行弓形虫不同毒株的GRA1基因测序,为研究其同源性及进一步应用研究创造了条件.
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人Six1基因缺失突变体对上皮钙黏素(E-cadherin)启动子活性的影响
Sine oculis homeobox homolog(Six)基因为同源盒基因,早发现于果蝇,是一种在多种生物中均有表达且高度保守的转录因子,不仅参与调控胚胎的正常发育和器官形成,还参与多种肿瘤的发生发展[1].胃癌细胞Six1高表达增加胃癌细胞的侵袭能力[2].在胰腺癌细胞中,Six1能够通过上调细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达促进胰腺癌细胞的增殖[3].Six1的过表达是结直肠癌的一个独立预后标志[4].上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肿瘤的发生与迁移过程中起着十分重要的作用,而上皮钙黏素(epithelial-cadherin,E-cadherin)和神经钙黏素(nerve-cadherin,N-cadherin)是EMT过程中的关键因子,在EMT中,常伴有E-cadherin的功能缺失[5].
关键词： Six1 E-cadherin 上皮间质转化 重组质粒 启动子
