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慢病毒介导的ebv-miR-BART7稳定过表达鼻咽癌细胞株CNE1的建立
目的 构建ebv-miR-BART7慢病毒表达载体.建立其稳定表达的鼻咽癌细胞株CNE1-pLVTHM/BART7.方法 构建慢病毒表达质粒pLVTHM/BART7.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染CNE1细胞.经流式细胞仪筛选后,建立稳定表达ebv-miR-BART7鼻咽癌细胞株.后用荧光定量PCR检测其表达水平.结果 PCR和测序验证pLVTHM/BART7重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染CNE1细胞后,与阴性对照组和未感染组相比,其表达水平明显升高.结论 成功构建了pLVTHM/BART7慢病毒重组质粒,建立了稳定表达ebv-miR-BART7的鼻咽癌细胞株CNE1-pLVTHM/BART7,为研究ebv-miR-BART7在鼻咽癌发生发展过程中的基因调控和相应的作用机制提供了有用的细胞模型.
关键词： ebv-miR-BART7 慢病毒 重组质粒 鼻咽癌细胞 -
Cycl慢病毒干扰载体的构建及在鼻咽癌细胞中干扰效率检测
目的 检测Cycl在鼻咽癌中的表达.构建稳定干扰Cycl慢病毒载体及检测其在鼻咽癌细胞中的干扰效率.方法 应用基因芯片技术检测Cycl基因在鼻咽癌组织中的表达.Real-time PCR确证Cycl基因在鼻咽癌组织和细胞中高表达.构建重组靶向Cycl的shRNA慢病毒质粒pLentiU6/Cycl-shRNA.建立稳定干扰Cycl基因的鼻咽癌细胞系,荧光定量PCR检测干扰效率.结果 基因芯片检测显示,Cycl基因在鼻咽癌组织中高表达.qRT-PCR确证了墓因芯片结果的可靠性.在8个鼻咽癌细胞株中,Cyc1基因基本上都显示了高表达,其中高的为鼻咽癌5-8F细胞.测序验证pLentiU6/Cycl-shRNA重组质粒构建成功.重组质粒能明显稳定地抑制Cycl基因在鼻咽癌细胞中的表达.结论 Cycl 基因在鼻咽癌中高表达.构建的靶向Cycl基因的慢病毒载体能明显抑制其表达.这为研究Cycl基因在鼻咽癌中的功能及分子机制奠定了基础.
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慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立
目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.
关键词： 真核翻译起始因子4G1 慢病毒 重组质粒 RNA干扰 鼻咽癌细胞 -
重组hGM-CSF乳酸链球菌的构建及初步验证
目的 运用基因克隆技术将自行合成的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)转化于乳酸链球菌.并筛选获得高表达重组hGM-CSF的乳酸链球菌稳定株.方法 将经过优化适合在乳链菌表达的hGM-CSF基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽、终止密码子的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF,然后将pNCSF进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,获得乳链菌表达载体pTRCSF,通过电穿孔转化于乳链菌,并通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳验证hGM-CSF的表达.结果 获得了重组质粒pNCSF并经酶切鉴定和测序证实.酶切鉴定显示构建乳链菌表达载体pTRCSF及重组hGM-CSF乳链菌成功,蛋白电泳初步验证获得了高表达重组hGM-CSF的乳链菌株LL-CSF.结论 运用基因克隆技术成功构建了重组乳酸链球菌LL-CSF,为进一步研究重组hGM-CSF的生物学特性及评价其潜在临床.应用价值打下了基础.
关键词： 粒-巨噬细胞集落刺激因子 乳酸链球菌 基因克隆 重组质粒 蛋白表达 -
重组质粒的快速酚筛法的改进
介绍一种重组质粒的粗筛技术,该法简便、快速、经济、有效,特别适用于单酶切、钝端连接及T-载体连接的重组质粒.
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以β-淀粉样蛋白为靶的单价及二价真核表达载体的构建和表达
[目的]构建以β-淀粉样蛋白为靶单价及二价真核表达载体pcDNA3.1-Aβ1-42、pcDNA3.1-Aβ42x2,并在真核细胞中表达目的蛋白.[方法]PCR法扩增编码β-淀粉样蛋白的目的基因,利用基因克隆技术构建单价及二价真核表达载体;应用酶切及测序鉴定真核表达载体构建成功后,用Westem blot和细胞免疫组化染色检测其在真核细胞中的表达.[结果]相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段(分别为137 bp和269 bp),测序未发现突变;Westem blot结果可见两条约为4 ku和8 ku的条带,细胞免疫组化染色可见阳性细胞.[结论]单价及二价真核表达载体构建成功;真核表达载体能在真核细胞中表达出目的蛋白.
关键词： 老年性痴呆 β-淀粉样蛋白 Tg2576转基因鼠 重组质粒 真核表达载体 -
pCMV －Myc －MyD88重组质粒构建及其在293 T细胞中的表达
目的：构建髓样分化因子88（MyD88）真核表达质粒，并检测其在293T细胞中的表达，为进一步研究应用奠定实验基础。方法从大鼠肝星状细胞株T－6中提取总RNA，应用PCR技术扩增MyD88基因编码序列片段，克隆入真核表达载体pCMV－Myc质粒中，对重组质粒经酶切和测序鉴定后，以钙离子转染法转染至293T细胞中，采用Western blot的方法检测MyD88蛋白的表达，以观察转染及表达效果。结果酶切及测序结果证明pCMV－Myc－MyD88重组质粒的DNA序列正确，将其转染至293T细胞后，MyD88蛋白表达明显增加。结论pCMV－Myc－MyD88重组质粒构建成功，并能在293T细胞中表达，为进一步研究针对MyD88分子的疾病治疗及其生物学功能奠定了实验基础。
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PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化
目的 构建PML-RAR o[融合基因相关重组表达质粒,在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化.方法 利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)以PML-RAR α全长质粒为模板分别扩增出长度均为1 200 bp的PML和RAR o[序列,并将它们分别插入PET32a(+)质粒中,构建重组表达质粒,化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆,菌落PCR筛选阳性转化子,双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性.正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a(+)和Flag-RARα-PET32a(+).将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用表达蛋白的组氨酸“标签”(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质.结果 PCR扩增获得目的基因,重组表达质粒经EcoRI/HindⅢ双酶切和测序鉴定证明构建正确.转化感受态BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白.结论 成功构建重组表达质粒,并经诱导表达后可纯化出目的蛋白,为进一步的抗体制备等实验奠定了基础.
关键词： PML-RARα融合基因 重组质粒 蛋白表达 蛋白纯化 急性早幼粒细胞白血病 抗体制备 -
pPICZαA-CDK2重组质粒的构建及表达
目的:构建含有细胞周期依赖性激酶2(CDK2)的胞外分泌型pPICZαA-CDK2重组质粒,利用毕赤酵母表达体系表达CDK2蛋白.方法:从人白细胞中提取总RNA,逆转录后采用聚合酶链反应扩增出CDK2基因,并将其插入pPICZαA质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌JM109进行克隆.重组质粒pPICZαA-CDK2转化毕赤酵母菌株GS115,甲醇诱导酵母细胞进行蛋白表达,SDS-PAGE和Western-Blot鉴定蛋白表达情况及抗原性.结果:PCR电泳及DNA测序证实CDK2基因已正确克隆到表达载体中;重组质粒转入酵母菌GS115,酵母经甲醇诱导表达后经SDS-PAGE检测发现在34 000左右有条带,Western-Blot检测发现有与CDK2单抗结合蛋白.结论:成功构建重组质粒,初步判断CDK2全长蛋白在毕赤酵母中表达成功且抗原性良好.
关键词： 细胞周期蛋白依赖激酶2 重组质粒 毕赤酵母 -
不同剂量人β防御素-2转染大鼠子宫内膜异位模型的表达特点
目的:观察将不同剂量的重组质粒pLXSN-hBD2转染大鼠子宫内膜异位症(EMS)模型后,其局部异位病灶组织中hBD-2蛋白表达的特点,以明确动物实验的疗效观察中重组质粒的剂量和时间.方法:构建重组质粒pLXSN-hBD2后,根据不同质粒的剂量,将大鼠EMS模型随机分为2 μg组和0.2μg组,分别在大鼠异位病灶局部多点注射2μg和0.2μg pLXSN-hBD2,采用PCR、免疫印迹法检测异位病灶组织内基因组DNA和hBD-2蛋白表达,进行外源基因转染整合的鉴定.同时观察不同剂量pLXSN-hBD2转染后2周内(2、7、14 d)局部病灶组织中hBD-2的蛋白表达变化.结果:转染2d后,大鼠EMS模型局部异位病灶组织中检测到明显的hBD-2蛋白的表达,其表达水平随着时间的延长而逐渐衰减,但在转染后2、7、14 d,2μg组的hBD-2蛋白表达均明显高于相应的0.2 μg组.结论:通过局部多点注射的方法,可将携带hBD-2基因的重组质粒pLXSN-hBD2成功转染至大鼠EMS异位病灶组织中,并获得至少持续约2周的hBD-2的蛋白表达,2μg重组质粒可用于动物实验的疗效观察.
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人KIM-1基因实时荧光定量PCR标准质粒的构建
目的 制备用于人KIM-1基因mRNA实时荧光定量PCR检测的标准品质粒.方法 通过PCR扩增出目的片断,纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,转化宿主菌E.coli DH5α,获得阳性克隆;通过PCR扩增鉴定和测序分析,确认重组质粒完整正确.提取重组质粒测定DNA浓度后,10倍倍比稀释,建立KIM-1质粒标准品.结果 KIM-1基因目的片段成功重组至pMD18-T载体上,扩增目的片段长度为131 bp,测序结果证实所构建的质粒序列与NCBI基因库KIM-1序列性一致.结论 成功构建KIM-1基因实时荧光定量PCR标准品质粒.
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pCMV-tag2B-HBX质粒的构建和表达
目的 构建乙型肝炎病毒X基因(HBX)的真核表达质粒,诱导并鉴定其表达.方法 将克隆获得的HBX全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV-tag2B,构建HBX的重组表达载体pCMV-tag2B-HBX,经DNA测序证明HBX的cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基顺序,将重组质粒转染HepG2细胞系,诱导其表达,用Western Blot进行鉴定.结果 构建的重组表达载体pCMV-tag2B-HBX经双酶切表明有相应大小的DNA片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的X基因,用脂质体转染法可将pCMV-tag2B-HBX导入HepG2细胞并成功表达,目的 蛋白经Western Blot鉴定具有生物学活性.结论 成功构建了HBX真核表达质粒pCMV-tag2B-HBX,重组质粒能表达具有生物学活性的HBX蛋白,为研究HBX的功能打下了基础.
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pUC19-pbp2b重组质粒转化对肺炎链球菌感受态菌株耐药性的影响
目的 探讨pUC19-pbp2b重组质粒转化对肺炎链球菌(SP)感受态菌株耐药性的影响.方法 收集13株对青霉素不敏感的SP菌株,其中8株青霉素结合蛋白(PBPs)编码基因pbp2b未突变,5株pbp2b基因突变,制备SP感受态.化学合成含SSN保守区的pbp2b基因片段,构建pUC19-pbp2b重组质粒,将重组质粒转化感受态菌株.测定青霉素、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松和头孢吡肟5种β-内酰胺酶类抗生素(BLA)对转化前后SP感受态菌株的小抑菌浓度(MIC).结果 pbp2b基因扩增产物可见约300 bp的特异条带,13株SP菌株均能形成感受态.与转化前菌株比较,5种抗生素对转化后菌株的MIC均降低(P＜0.05).5种抗生素对5株转化后的pbp2b基因突变菌株的MIC均降低(P＜0.05).结论 外源重组质粒转化SP感受态可以协助减缓SP耐药性的进展.
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人Ⅰ型干扰素受体亚基表达对IFN-α抑制HBV复制水平的影响
目的 探讨人Ⅰ型干扰素受体亚基(IFNAR1)不同表达水平对IFN-α抑制HBV复制的影响.方法 扩增在前期构建的IFNAR1不同表达水平稳定HepG2细胞(R1/H1、R1/H2、R1/H3株和对照细胞PS1、PGFP细胞),分别以瞬时转染HBV表达质粒pUC 19-1.24HBV和对照质粒,培养24h后加入IFN-α,48h后收集细胞采用Southem blot检测HBVD-NA,荧光定量PCR检测细胞和上清HBVDNA水平.结果 Southern blot检测提示IFN-α干预后HBV复制水平在R1/H1和R1/H2细胞及R1/H3株中IFN-α抑制细胞内核壳颗粒HBVDNA活性显著高于PS1和PGFP细胞;荧光定量PCR结果提示R1/H3细胞中细胞和上清HBVDNA水平较R1/H1、R1/H2细胞系无显著下降.结论 IFNAR1蛋白表达水平不同可能导致IFN-α抑制HBV复制效应的差异.
关键词： 人Ⅰ型干扰素受体亚基 IFNAR1基因 重组质粒 稳定表达细胞 -
PET32a-IL-1RⅠ重组质粒的构建及表达
目的 构建含有编码白细胞介素1 Ⅰ型受体(IL-1R I)胞外区蛋白基因的PET32a-IL-1RⅠ重组质粒,利用原核表达体系表达 IL-1RⅠ的胞外区蛋白.方法 从人白细胞中提取总RNA,采用聚合酶链反应(PCR)从总RNA中扩增出IL-1RⅠ胞外段基因,并将其插入PET32a质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌DH5α进行克隆.将克隆得到的PET32a-IL-1RⅠ重组质粒转化入表达菌株BL21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其蛋白表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-Blot鉴定蛋白表达效果.结果 菌落PCR及DNA测序证实IL-1RⅠ胞外段基因已正确克隆到载体中;重组质粒成功转入表达菌株BL21(DE3),SDS-PAGE和Western-Blot结果显示表达菌经IPTG诱导后表达出相对分子质量为67×103左右的蛋白.结论 成功地克隆了人IL-1RⅠ胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达,为IL-1RⅠ的进一步研究打下了基础.
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结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达
目的 构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白.方法 将目的 基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2.结果 成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21(DE3)plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化.结论 成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103 、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达.
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乙型肝炎DNA疫苗系列质粒的构建及其在SP2/0细胞中的表达
近年来兴起的核酸疫苗对某些病毒感染同时具有预防和治疗作用。我们构建了一系列能表达乙型肝炎病毒大、中、小蛋白的疫苗质粒，并研究了其在SP2/0细胞中的表达情况。一、材料与方法1. S、MS、LS蛋白编码基因片段的获取：以含有adr亚型HBV全基因组pBHB4质粒为模板，用3对人工合成的引物SF/SR、S2F/SR、S1F/SR分别扩增编码小蛋白S（nt28-708）、中蛋白MS（nt3077-708）和大蛋白LS（nt2719-708）的DNA片段。引物SF、S2F和S1F分别互补于S、前S2和前S1基因起始区域，SR则互补于S基因相应的终止区。2. S1S重组基因片段的获取：采用重叠扩增PCR法对S1S2S基因进行剪切和重组，即获得不含S2的S1S重组基因片段。3. 重组质粒的构建及鉴定：将上述获得的S、S1S、S2S及S1S2S基因片段分别插入质粒pSG5UTPL/Flag载体的SV40启动子下游和质粒pRc/CMV载体的CMV启动子下游。将以上8个重组质粒转化大肠杆菌XL Blue 1，经菌落PCR鉴定技术筛选含相应插入片段的阳性克隆，然后抽提、扩增、纯化并酶切鉴定，以373A型核酸自动分析仪测定所插入片段的核酸序列。4. 重组质粒在SP2/0细胞中的表达：将纯化的质粒转染SP2/0细胞并筛选、建立长期转染细胞株。分别收集部分转染细胞，超声破碎后收集上清液，以Western-Blot检测相应蛋白质在SP2/0细胞中的表达情况。
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HBV反义全基因真核细胞表达载体的构建及在肝癌细胞内的表达
1. 材料与方法：乳哺动物细胞表达载体pBK-CMV，长约4.5kb，带有T7公用序列。pCP10是pBR322 EcoRI位点中插入双拷贝头尾相接的HBV ayw亚型全基因HBV DNA重组质粒。PCR引物XI1：1428-1448 nt 5′CGT CCC GTC GGC GCT GAA TCC 3′，XI2：1672-1653 nt 5′AGT CCA AGA GTC CTC TTA AG 3′。人肝癌细胞系SMMC-7721，由上海细胞所提供。将EcoRⅠ酶切后回收的全基因HBV片段，在T4 DNA连接酶作用下，与EcoRⅠ酶切后的pBK-CMV粘端连接。利用pBK-CMV具有T7公用序列，选用XI2、T7作为引物，PCR出现1.7kb阳性条带为反接，并命名为pBK-AHBV。用FUGENETM6转染试剂转染SMMC-7721细胞。在含10%FCS的RPMI 1640（pH7.4）培养基中培养至60h后，用总RNA抽提试剂（Trizol Reagent）提取转染的SMMC-7721细胞，依次获得总RNA、DNA。
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空肠弯曲菌Pen:19 cadF基因真核表达重组质粒的构建与表达
目的:构建空肠弯曲菌Pen:19 cadF基因真核表达重组质粒,并证实其能在COS-7细胞中表达.方法:以含有KpnI和EcoRI酶切位点的同一对引物行PCR反应,获得空肠弯曲菌Pen:2、Pen:8、Pen:19和Pen:21 cadF基因DNA片段.并选择与格林-巴利综合征为相关的空肠弯曲菌Pen:19 PCR产物为目的基因片段,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,以构建重组质粒pcDNA3.1(+)-cadF.重组质粒经双酶切、PCR反应鉴定和DNA双向测序确认后转染至COS-7细胞.运用R T-PCR方法检测重组质粒在细胞mRNA水平的表达.结果:双酶切反应、PCR反应和DNA双向测序证实cadF基因插入成功.采用RT-PCR方法能够从重组质粒转染的COS-7细胞中扩增出与目的基因大小一致的DNA片段.结论:空肠弯曲菌Pen:19 cadF基因真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-cadF构建成功,并能在COS-7细胞中表达.为空肠弯曲菌DNA疫苗的研究奠定了良好的基础.
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靶向呼吸道合胞病毒M2基因pshRNA载体质粒的构建及意义
目的:构建针对呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因mRNA的短发卡结构状RNA(shRNA)重组载体质粒,为利用RNA干扰技术抗RSV感染的深入研究奠定基础;方法:按shRNA设计原则,选择RSV-M2基因作为靶基因,设计19bp长的能产生短发卡结构的两段DNA反向重复序列,中间以9bp序列间隔,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pgenesil-1上,重组质粒经酶切和测序鉴定,然后将构建成功的重组质粒转染HEP2细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞发生率以评估转染效率.结果:将设计合成的DNA片段成功克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列,并且荧光显微镜下观察细胞有较多的绿色荧光蛋白表达.结论:成功构建了针对RSV M2基因mRNA的shRNA重组载体质粒,可利用重组质粒进一步研究其对RSV感染的抑制,从而为抑制RSV感染寻找新的基因治疗手段.
