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表达HBVX基因的小鼠模型的建立及对肝细胞凋亡因子的影响
目的:探讨乙型肝炎病毒X(HBVX)基因及其产物对肝细胞凋亡相关基因表达的影响.方法:将实验用SPF级成年♂KM小鼠分为实验组、空质粒对照组、生理盐水对照组.实验组以构建好的PCDNA3.1-HBVX质粒,空质粒对照组以PCDNA3.1质粒,生理盐水对照组以生理盐水,通过尾静脉高压注入动物体内,在第48小时处死小鼠后,取肝组织,以RT-PCR,凝胶回收测序及Western blot检测HBVX表达,以RT-PCR半定量检测小鼠肝组织内bax、c-myc及bcl-2的表达.结果:实验组RT-PCR显示465 bp处有清楚条带,肝组织内有HBVX mRNA的存在,两对照组无HBVX mRNA存在,Western blo检测实验组有HBVX蛋白的表达;两对照组则无HBVX蛋白表达.通过对小鼠肝组织凋亡相关因子的半定量RT-PCR,相对于空质粒对照组和生理盐水对照组,转染HBVX基因的小鼠肝组织bax、c-myc及bcl-2的mRNA相对表达量明显增高,差异有显著性意义(bax:1.3127±0.0900vs 1.0023±0.1670,0.9094±0.1081;c-myc:1.6294±0.0672 vs 1.2869±0.0880,0.9757±0.0397;bcl-2:1.5567±0.1257 vs 0.6856±0.1554,0.5488±0.1278,均P<0.05).结论:成功建立了表达HBVX的小鼠动物模型,并证明转染HBVX基因后小鼠肝脏组织内bax、bcl-2及c-myc的mRNA表达同时上调.
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pHBx-EGFP载体构建及其在肝癌Bel 7402细胞中的表达
目的:构建乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)-X蛋白(hepatitis B virus x protein,HBx)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)真核融合蛋白表达载体(pHBx-EGFP),转染肝癌Bel 7402细胞,观察其表达和定位,为进一步研究HBx功能提供工具.方法:以pcDNA3.1-HBx为模板,应用PCR和DNA重组技术构建增强型绿色荧光蛋白HBx-EGFP融合蛋白表达载体pHBx-EGFP,经脂质体转染Bel 7402细胞,应用倒置荧光显微镜观察融合蛋白表达和定位；同时提取转染pHBx-EGFP 24 h后的Bel 7402细胞总蛋白,应用Western blot技术,鉴定HBx在细胞的表达情况.结果:成功扩增HBx片段插入pEGFP载体,经酶切验证后测序正确；pHBx-EGFP转染Bel 7402细胞24 h后,荧光显微镜下观察显示HBx-EGFP存在于细胞核周区域,而EGFP则弥散分布于整个细胞；Western blot得到HBx-EGFP、EGFP和HBx目的条带,结论:成功构建pHBx-EGFP真核重组蛋白表达载体,通过检测绿色荧光蛋白标记显示其在Bel 7402细胞中表达及定位,并证实pHBx-EGFP载体能在Bel 7402细胞正确表达.
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肝细胞中HBV X基因的表达及其共培养的肝星状细胞的增殖和迁移
目的:研究乙型肝炎病毒X(hepatitis B virus X,HBV X)基因在乙型肝炎病毒致肝纤维化中的作用.方法:构建HBV X基因真核表达载体pHBV-X-IRES2-EGFP,将其转染人肝细胞HL-7702后分成2组,一组经G418筛选出稳定表达HBVX基因的肝细胞株(L02/x),另一组予瞬时转染48 h(L02/48x).Real-time PCR、Western blot鉴定2组细胞HBV X基因的表达.与转染空质粒和未转染的肝细胞组对照,将L02/x和L02/48x细胞分别与肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)共培养36 h,并检测各组HSCs增殖和迁移情况.结果:Real-time PCR和Western blot实验显示,转染pHBV-X-IRES2-EGFP载体的L02/x和L02/48x细胞均有HBV X基因的表达,与转染空质粒和未转染的肝细胞组对照,与L02/x和L02/48x细胞共培养的HSCs的增殖和迁移均显著增多.结论:HBV X基因在肝细胞中的表达可以促进HSCs发生增殖和迁移,从而在乙型肝炎病毒致肝纤维化过程中起重要作用.
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HBx上调HepG2细胞DNA修复酶hMTH1表达的意义
目的: 探讨DNA氧化损伤修复酶hMTH1在HBx致肝细胞癌发生机制中的作用.方法: 应用HPLC/ECD法检测稳定表达HBx的转基因细胞HepG2/HBx及其对照组HepG2与HepG2/pcDNA3.1细胞中的8-OHdG的含量;并以β-actin为内对照, 应用RT-实时PCR定量检测各组细胞中可水解8-OHdG的DNA修复酶hMTH1的表达.结果: 8-OHdG在He pG2/HBx细胞中的含量(fmol 8-OHdG/mg DNA)显著高于对照组HepG2和HepG2/pDNA3.1细胞(36.5±6.25 vs8.52±1.65, 9.12±2.69, 均P<0.05). DNA修复酶hMTH1在HepG2/HBx细胞中的表达较两对照组细胞明显增高(1.213±0.100 vs 0.087±0.026, 0.112±0.052 hMTH1/β-actin mRNA×100, 均P<0.05).结论: H B x 可能通过诱导氧化应激增加HepG2细胞内DNA氧化损伤产物8-OHdG的含量, 从而反应性上调DNA修复酶hMTH1的表达.
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DNA修复酶hMTH1在乙型肝炎病毒x基因致人肝细胞系L02细胞恶性转化中的意义
目的 通过转摹因细胞模型L02/HBx观察乙型肝炎病毒x基因(HBx)对DNA修复酶hMTH1转录表达的调控及其对人肝细胞系L02细胞生物学特性的影响.方法 传代培养稳定表达HBx的转基因细胞模型ID2/HBx及空白对照组ID2细胞和空载体对照组L02/pcDNA3.1细胞,倒置显微镜下观察各组细胞的形态学特征,以四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、流式细胞术枪测各组细胞增殖、细胞周期和凋亡状况,并进行软琼脂克隆形成实验观察细胞的恶性转化能力.同时应用实时定量PCR测定各组细胞DNA修复酶hMTH1的表达水平.结果 镜下观察发现L02/HBx细胞与对照组ID2细胞相比形态发生明显改变.MTT法显示L02/HBx细胞生长速度比两对照组显著加快.流式细胞术结果表明,HBx可加速细胞周期进程、抑制细胞凋亡.软琼脂克隆形成实验发现L02/HBx细胞的克隆形成率明显高于L02细胞和ID2/pcDNA3.1细胞(P<0.05).实时定量PCR检测发现hMTH1在L02/HBx细胞中的表达显著高于L02细胞和L02/pcDNA3.1细胞(P<0.05).结论 HBx可诱导L02细胞发生恶性转化,在此过程中DNA修复酶hMTH1可出现反应性的上调表达.
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乙型肝炎病毒X基因在体内外对肝癌细胞增殖活性的影响
目的探讨乙型肝炎病毒x(HBx)基因对肝癌细胞增殖活性的影响.方法将携带HBx基因的表达质粒pHA-HBx转染HepG2肝癌细胞,G418筛选阳性细胞克隆,RT-PCR鉴定HBx基因的整合及表达;通过细胞计数,观察HBx基因对肝癌细胞生长曲线和倍增时间的影响;流式细胞术检测细胞周期的变化;3H-TdR掺入法检测细胞增殖活性;裸鼠接种观察HBx基因在体内对肝癌细胞增殖的影响.结果 HBx基因在体内外对HepG2细胞的增殖活性均有明显影响,细胞生长曲线左移,倍增时间缩短;G0/G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞增多;转染后的细胞3H-TdR掺入率较对照组增高;转HBx基因的裸鼠移植瘤的生长速度较对照组细胞明显加快.结论 HBx基因在体内外均可提高肝癌细胞的增殖活性,增加肝癌细胞的恶性表型,加速肿瘤生长.
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siRNA沉默HBx基因对肝癌细胞YKL-40蛋白表达影响的研究
目的 观察HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒X(HBx)基因沉默对酿酒酵母YKL-40蛋白表达的影响.方法 构建靶向HBx基因的siRNA真核表达载体pRNAT-HBx和阴性对照质粒,同时设空白对照组,采用Lipofectinamine 2000脂质体转染法转染人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞.采用RT-PCR检测各组中HBx和YKL-40的mRNA水平,Western blot、细胞免疫荧光检测各组中HBx蛋白和YKL-40蛋白的表达.结果 pRNAT-HBx明显抑制HepG2.2.15细胞中HBx基因的表达,同时YKL-40的mRNA和细胞内蛋白表达水平也随之相应下调.结论 抑制HBx基因的表达能下调HepG2.2.15细胞中YKL-40蛋白的表达,提示HBx蛋白对YKL-40蛋白的表达具有一定的激活作用.
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RNA干扰肝癌细胞HBX基因表达及细胞增殖的实验研究
目的 探讨RNA干扰技术对肝癌细胞乙型肝炎病毒X基因(HBX)表达和细胞增殖的影响.方法 鉴定转染无关的对照序列(HK3细胞)和针对HBX基因shRNA的稳定肝癌细胞株(21543细胞);RT-PCR检测RNA干扰对HBX基因mRNA沉寂作用,利用流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 复苏后细胞形态差别不大;RT-PCR显示相对于MHCC-97H细胞,21543细胞的HBX mRNA水平的下降约91%,HK3细胞的HBX mRNA水平下降不明显;靶向HBX的RNA干扰后的肝癌细胞(21543细胞)较原肝癌细胞(MHCC-97H细胞)和对照细胞(HK3细胞)增殖明显减慢,而后两种细胞差别不显著;21543细胞周期显示RNA干扰后细胞延缓进入S期,增殖活性明显减低.结论 RNA干扰可降低肝癌细胞HBX表达水平,并可明显抑制肝癌细胞的增殖,改变细胞生长周期.
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HBx基因与乙型肝炎病毒相关性肝癌的关系
肝细胞癌( HCC )患者大多伴有乙型肝炎病毒( HBV)感染,且基本都经历了"乙型肝炎-肝硬化-HCC"的发展三部曲过程. 研究显示,通过提高对HCC的监视和新治疗方案的发展, HCC 患者3 年、5年、10 年累积生存率分别是 62. 1％, 44. 3％ 和20. 5％ 〔1〕. HBV感染是引起HCC发生发展的重要生物因素. 由HBV x基因( HBx)编码的乙肝病毒X蛋白( HBX)是一种多功能蛋白,与HCC 的发生发展关系密切. 研究HBx基因作用靶点和作用机制,对进一步了解和治疗由HBV感染导致的HCC有重要作用.本文综述HBx基因与HBV相关性HCC的关系.
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乙型肝炎病毒x基因转染肾小管上皮细胞导致细胞凋亡的机制探讨
目的:探讨乙型肝炎病毒x基因(HBx)转染人近端肾小管上皮细胞系(HK-2细胞)后对其凋亡及细胞因子分泌的影响及可能机制. 方法:体外培养HK-2细胞,用分子克隆法构建pcDNA3.1/myc-HBX质粒,采用脂质体转染法瞬时转染HK-2细胞,实时荧光定量PCR (RT-PCR)及蛋白印迹法验证HBx在HK-2细胞中的表达.以未转染质粒组和转染空载质粒pcDNA3.1/myc组作为对照,显微镜观察转染HBx基因后HK-2细胞形态,RT-PCR检测各组细胞Toll样受体4(TLR4) mRNA水平,蛋白印迹法检测各组细胞TLR4的表达,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,ELISA检测细胞培养上清中白细胞介素4(IL-4)、干扰素γ(IFN-γ)水平. 结果:转染pcDNA3.1/myc-HBx质粒后的HK-2细胞中HBx mRNA和蛋白表达水平明显增加,证实转染成功；转染HBx基因组细胞形态不规则,细胞状态受损；与对照组相比,转染HBx基因组TLR4的表达水平明显上调(P＜0.05),凋亡细胞数量明显增多(P＜0.05),细胞上清液中IFN-γ水平增加,但IL-4水平降低. 结论:经构建pcDNA/myc-HBx质粒并转染肾小管上皮细胞可成功制备乙肝病毒细胞感染模型,由此导致的肾小管上皮细胞凋亡可能与HBx引起肾小管上皮细胞TLR4的表达上调有关,HBx亦能导致细胞因子分泌紊乱.
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乙型肝炎病毒X基因对正常肝细胞HL7702凋亡影响的初步探讨
目的 研究乙型肝炎病毒X基因(HBX基因)对HL7702肝细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法 用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3.1(+)-X瞬时转入HL7702细胞,以转染空质粒pcDNA3.1(+)的细胞及未转染的HL7702细胞为对照.转染后72 h收集细胞标本,作以下处理:RT-PCR法检测HBX mRNA的表达,免疫荧光鉴定HBx蛋白的表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;以β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA的表达量变化.结果 转染72h后,转染pcDNA3.1(+)-X真核表达载体的HL7702细胞经RT-PCR扩增出HBX片段,免疫荧光结果 显示细胞内出现HBx蛋白的较强荧光;而转染空质粒组及未转染对照组经RT-PCR法及免疫荧光检测均显示无HBx表达.通过流式细胞术和半定量RT-PCR法检测细胞凋亡情况,结果 显示:转染HBX的细胞凋亡率(3.38%±0.67%)相对于转染空质粒组(1.25%±0.30%)及未转染质粒组(1.40%±0.37%)凋亡率增高, 差异均有显著性意义(P<0.05);转染HBx的细胞Bax mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异均有显著性意义(P<0.05),Bcl-2 mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显降低,差异均有显著性意义(P<0.05).转染空质粒组和未转染质粒组之间,对细胞凋亡率、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA进行比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论成功将HBX转染入HL7702细胞,并在细胞中表达;转染后72 h HBx可上调Bax表达,而下调Bcl-2表达,表明HBx能促进HL7702细胞凋亡.
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原发性肝癌患者HBVX基因与内分泌激素相关性的初步研究
为了解原发性肝癌(HCC)患者的内分泌激素水平与HBVX基因间的相互关系,探讨HBV相关性HCC发生中内分泌激素的作用,用聚合酶链反应技术-限制片段长度多肽性分析法(PCR-RFLP)检测48例原发性肝癌患者血清HBVX基因,并与用放射免疫法(RIA)检测的血清睾酮(T)、雌二醇(E2)、生长激素(HGH)、泌乳素(PRL)、C肽水平进行相关分析.结果表明,HBVX基因阳性原发性肝癌患者血清HGH水平显著高于阴性组(t＝3.38,P＜0.01);T水平显著低于阴性组(t＝2.24,P＜0.05).HBVX基因阳性肝癌患者C肽水平与E2高度正相关(r＝0.861,P＜0.01),与T正相关(r＝0.380,P＜0.05);血清HGH水平与E2正相关(r=0.471,P＜0.05).结果提示:HGH、T、E2水平的改变与HBV相关性HCC发生有关;其中E2、胰岛素和HGH可能有协同作用.
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叶下珠水提物对裸鼠人肝癌移植瘤HBx和VEGFR3表达的影响
目的 探讨乙型肝炎病毒x基因(hepatitis B virux x gene,HBx)和血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR3)基因与乙型肝炎相关肝癌的相关性,以及叶下株水提物(aqueous extract of phyllanthus urinaria L,AEP)对HBx和VEGFR3蛋白表达的干预作用.方法 将60只Balb/c-nu裸鼠随机分为10组.分别复制转染HBx、氯霉素乙酞转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)和VEGFR3基因的HepG2肝癌细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,用AEP进行干预,以生理盐水、环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)作为对照,共治疗6周.观察模型复制后不同时间各组裸鼠的移植瘤生长状况,采用酶联免疫吸附试验检测各组裸鼠血清甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)水平,采用Western blot方法检测移植瘤组织中HBx和VEGFR3蛋白表达水平.结果 肝癌移植瘤模型复制成功.各组裸鼠体质量均随着时间显著增长.实验结束时,接种HepG2-HBx细胞的各组中,AEP处理组肿瘤质量显著低于CTX处理组(P＜0.05),其AFP水平显著高于NS处理组(P＜0.05),其移植瘤组织中HBx表达水平显著低于NS组(P＜0.05).接种相同肝癌细胞的各组中,AEP处理组VEGFR3表达水平低,但与CTX组VEGFR3表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05);AEP组和CTX组VEGFR3表达水平显著低于NS组(P＜0.05).对于相同的处理因素,接种HepG-HBx细胞和HepG-CAT细胞的裸鼠移植瘤组织中VEG-FR3表达水平均显著低于接种HepG-VEGFR3细胞的裸鼠(P＜0.01).结论 AEP通过直接抑制HBx蛋白和VEGFR3蛋白表达,及通过抑制HBx蛋白表达而间接抑制VEGFR3蛋白表达,达到对肝癌移植瘤生长的抑制作用.
关键词： 叶下珠 乙型肝炎病毒X基因 血管内皮生长因子受体3 肝癌 -
腺病毒介导HBx对人淋巴细胞影响的体外实验
目的 探讨体外条件下腺病毒介导乙型肝炎病毒x基因(HBx)在正常人外周血淋巴细胞中的复制扩增及其对淋巴细胞凋亡和白细胞介素-10(IL-10)分泌的影响.方法 淋巴细胞取自正常人外周血,分别用携带HBx的腺病毒Ad-HBx、空载腺病毒Ad-EGFP感染淋巴细胞(设为Ad-HBx组和Ad-EGFP组),未感染腺病毒的淋巴细胞作为空白对照组(Lymphocyte组).Q-PCR检测HBx在淋巴细胞内的复制扩增.ELISA检测3组淋巴细胞IL-10的表达.流式细胞术检测3组淋巴细胞的凋亡.结果 Q-PCR检测显示,Ad-HBx组淋巴细胞被Ad-HBx感染48 h后,细胞内HBx的表达较Ad-EGFP组和Lymphocyte组明显增高(P＜0.05).ELISA检测结果显示,Ad-HBx组淋巴细胞被Ad-H-Bx感染12、24、36、48 h后,IL-10的表达水平明显低于Ad-EGFP组和Lymphocyte组,差异有统计学意义(P＜0.001).流式细胞术检测结果显示,Ad-HBx组早期凋亡细胞明显多于其余2组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 体外环境下,HBx在正常人外周血淋巴细胞内能够完成复制扩增,明显抑制淋巴细胞IL-10的表达和促进淋巴细胞的早期凋亡.HBx对人免疫系统的调控作用可能是通过在人淋巴细胞内的基因表达、抑制抗炎性因子表达和促进早期凋亡实现的.
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稳定表达乙型肝炎病毒X基因肝细胞株的构建
目的 构建稳定表达乙型肝炎病毒X基因(HBVx)的正常人肝细胞株.方法 用PCR法扩增含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列,构建HBVx基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBVx,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并对其进行双酶切和测序鉴定;用脂质体转染法将HBVx基因导入Chang细胞系,G418筛选,RT-PCR和Western blot鉴定.结果 X基因亚克隆入pcDNA3.1(+),含有完整的X基因片段,转染后Chang细胞有HBVx mRNA表达,Chang/HBVx有HBVx蛋白的表达.结论 构建了稳定表达HBVx基因的肝细胞株Chang/HBVx.
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乙型肝炎病毒X基因突变与肝细胞癌
原发性肝细胞癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,慢性HBV感染是导致肝细胞癌的主要病因.HBV诱发肝细胞癌的确切机制仍不十分清楚.目前在HBV相关肝细胞癌病人血清和肝癌组织中发现了许多HBV X基因突变体,一些与肝细胞癌发生发展密切相关.本文主要就HBV X基因突变与肝细胞癌研究进展进行综述.
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HBx基因缺失型突变体QSG7701细胞转染模型的建立与鉴定
目的 建立稳定表达乙型肝炎病毒X基因缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431蛋白QSG7701肝细胞株.方法 HBxd382和HBx-d431基因经PCR和双酶切后,插入到真核表达载体pcDNA3中,构成重组质粒peDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431.应用基因转染的方法,将重组质粒分别转染到QSG7701肝细胞中,经G418筛选和RT-PCR、蛋白印迹鉴定,筛选出稳定表达HBx蛋白的细胞株.结果 经PCR、酶切及序列鉴定,重组质粒pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431构建成功.RT-PCR和Western blot结果湿示,该重组质粒能在QSG7701肝细胞中表达插入的HBx-d382和HBx-d431基因编码的融合蛋白.结论 成功建立了稳定表达羧基端截短的HBx蛋白肝细胞株HBx-d382和HBx-d431.HBx-d382和HBx-d431肝细胞模型的建立,为HBx-d382和HBx-d431基因及其蛋白的深入研究奠定了基础.
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肝细胞性肝癌组织中HBX蛋白与骨桥蛋白的表达
目的:了解肝细胞性肝癌(HCC)组织中HBX蛋白与骨桥蛋白(OPN)的表达情况.方法:采用免疫组化方法检测49例肝细胞性肝癌组织(其中高分化12例,中分化21例.低分化16例;伴肝硬化9例,甲胎蛋白阳性33例;有淋巴结转移、肝内转移、门静脉癌栓或远处转移者29例)、癌旁组织及10例乙型肝炎标志物阳性的正常肝组织中HBX蛋白与OPN的表达情况,分析二者在HCC组织和癌旁组织中的相关性.结果:HCC组织中HBX蛋白与OPN蛋白的阳性表达率分别为69.4%与81.6%,癌旁组织中分别为57.1%与71.4%,均明显高于正常肝组织(X2分别为20.051和27.579;P<0.05);HBX与OPN在HCC组织及癌旁组织的表达呈正相关,相关系数分别为0.516和0.426;有转移与无转移组问HBX与OPN蛋白的表达差异均有统计学意义(X2分别为5.890和6.235;P<0.05).结论:HBX蛋白与OPN在HCC的发生发展与转移中具有重要作用.
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肝细胞癌组织中乙型肝炎病毒X基因、COX-2及MMP-9的表达
目的:检测人原发性肝细胞癌(HCC)组织中乙型肝炎病毒X基因(HBX)、环氧化酶-2(COX-2)与基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达.方法:采用免疫组织化学方法检测49例HCC组织、癌旁组织及10例正常肝组织中HBX、COX-2与MMP-9蛋白的表达情况.结果:HCC组织中的HBX、COX-2及MMP-9蛋白的阳性表达率分别为69.4%、77.5%与61.2%,癌旁组织中的阳性表达率分别为57.1%、71.4%与79.6%,均明显高于正常肝组织(均为0.0%,P<0.05);HCC组织与癌旁组织中COX-2及MMP-9蛋白的表达与HBX蛋白的表达均分别呈线性相关;HCC组织中有转移与无转移组间HBX、COX-2与MMP-9蛋白的阳性表达率差异均有统计学意义(P<0.05).结论:在HCC的发生发展与转移过程中HBX、COX-2与MMP-9蛋白具有重要作用.
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稳定转染HBx基因的HepG2细胞株的建立及其对p53-p21途径的影响
目的 将构建的乙型肝炎病毒X基因的真核表达载体稳定转染HepG2细胞株,并研究转染后对p53-p21途径的影响.方法 用基因转染的方法将已构建的载体pcDNA3.1-HBx转染入肝癌细胞HepG2中,G418筛选出稳定转染X基因的细胞株.细胞生长曲线、平板克隆形成实验检测转染后肝癌细胞的恶性表型,流式细胞仪检测细胞凋亡和周期,Western blot检测p53蛋白的表达,RT-PCR检测p21基因.结果 成功筛选出pcDNA3.1-HBx稳定转染的HepG2细胞株;细胞生长实验、平板克隆形成实验显示稳定转染乙型肝炎病毒X基因的肝癌细胞恶性表型增高;流式细胞仪结果显示,转染后的细胞株凋亡率增高,G1/G0期细胞减少,G2期细胞增多;Western blot和RT-PCR分别显示,转染株p53蛋白表达增高,且下调p21基因水平.结论 乙型肝炎病毒X蛋白可刺激肝癌细胞生长,稳定转染X基因的细胞株可能通过p53-p21途径增加肝癌细胞的恶性表型.
