首页 > 文献资料
-
银杏内酯B对血小板活化因子引起的巨噬细胞趋化及细胞骨架改变的影响
目的考察银杏内酯B(ginkgolide B,BN52021)对血小板活化因子(PAF)引起的小鼠腹腔巨噬细胞趋化反应和丝状肌动蛋白(F-actin)聚合作用的影响.方法Boyden小室法检测化合物对巨噬细胞趋化的影响;流式细胞术检测特异性标记的巨噬细胞中F-actin的变化.结果PAF可显著刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生趋化效应,PAF受体拮抗剂BN52021(0.01 nml·L-1～0.1μmol·L-1)可明显抑制该作用.此外,在含钙缓冲液中,BN52021可显著抑制PAF引起的丝状肌动蛋白聚合.结论BN52021可能通过抑制丝状肌动蛋白的聚合作用,从而抑制PAF引起的巨噬细胞趋化,并且这种作用是钙依赖性的.表明BN52021的抗炎作用途径之一是抑制PAF诱导的趋化作用.
-
Y-27632抑制缓激肽选择开放血肿瘤屏障的研究
目的 研究Rho associated kinase(ROCK)特异性抑制剂Y-27632是否抑制缓激肽开放血肿瘤屏障.方法 应用EVOM测定仪测定跨内皮阻抗值,分析血肿瘤屏障的通透性;应用辣根过氧化物酶渗漏实验分析血肿瘤屏障的通透性;应用免疫荧光方法观察原代大鼠脑微血管内皮细胞丝状肌动蛋白结构和分布的改变.结果 BK作用15min时,跨内皮阻抗值低,辣根过氧化物酶流量高,血肿瘤屏障通透性高;此时大鼠脑微血管内皮细胞边界的丝状肌动蛋白分布不连续,应力纤维形成增加.ROCK的特异性抑制剂Y-27632显著抑制了由缓激肽引起的血肿瘤屏障通透性升高和应力纤维的增加.结论 Y-27632抑制缓激肽引起的血肿瘤屏障通透性升高,可能与丝状肌动蛋白结构和分布的改变和应力纤维的增加相关.
-
PTZ诱导的癫痫急性发作大鼠大脑神经元中F-actin、Calponin3和ROCK2的表达及其意义
目的:探讨戊四氮(PTZ)诱发的大鼠癫痫急性发作对大脑神经元中F-actin、Calponin3和ROCK2蛋白表达水平的影响,阐明癫痫急性发作时阻断F-actin异常解聚、触发F-actin重构的可能机制.方法:3周龄Wistar幼鼠56只分为对照组(n=6)和癫痫组(n=50).对照组大鼠给予腹腔注射生理盐水;癫痫组大鼠经腹腔注射60 mg.kg-1 PTZ建立癫痫急性发作模型,造模成功的24只大鼠分别在癫痫急性发作后的相应时间点(1、2、3和7d时)随机处死6只用于取材.采用Alex-488标记的phalloidine进行荧光染色观察大鼠大脑海马组织中分子层的F-actin荧光强度;采用免疫荧光染色法观察大鼠大脑皮层和海马神经元中Calponin3和ROCK2的分布;采用Western blotting法检测大鼠海马组织中Calponin3、ROCK2和磷酸化ROCK2蛋白的相对表达水平.结果:与对照组比较,癫痫急性发作ld后,癫痫组大鼠大脑树突棘密集的海马中分子层的F-actin荧光强度降低(P＜0.05),点状聚集结构消失.免疫荧光染色,对照组大鼠Calponin3在神经元胞质中弥漫性分布,而癫痫急性发作7d后,癫痫组大鼠神经元中Calponin3则聚集在细胞皮质;对照组大鼠ROCK2仅在少量神经元突起中分布,而癫痫急性发作7d后,癫痫组大鼠大量神经元胞体和突起中均可见ROCK2分布.Westernblotting检测,与对照组比较,癫痫组大鼠各时间点海马组织中Calponin3相对表达水平显著降低(P＜0.05),但是随着时间延长,1周内逐渐升高并趋向正常水平.与对照组比较,癫痫组大鼠海马组织中ROCK2蛋白相对表达水平从癫痫急性发作后3d开始显著增加并持续至造模后7 d(P＜0.05);磷酸化ROCK2蛋白相对表达水平则从癫痫急性发作后1d就开始显著增加并持续到7 d(P＜0.05),且随着时间延长逐渐降低.结论:PTZ诱导幼鼠癫痫急性发作导致F-actin异常解聚,同时激活RhoA/ROCK2信号途径,上调ROCK2和Calponin3蛋白表达水平.
-
Keap1调控丝状肌动蛋白的解聚与重组影响细胞运动
目的:探讨抑癌基因Keap1在细胞运动中的作用及其调控机制.方法:构建真核表达载体pIRES-EGFP-Keap1,应用Lipofectamine 2000脂质体转染COS-7和A549细胞并以其作为实验组,以其空载pIRES-EGFP转染细胞组为对照组,未转染组为正常组.免疫印迹检测两组细胞Keap1蛋白表达水平;采用划痕实验观察细胞迁移能力,免疫荧光显色显示细胞骨架F-actin的解聚与重组.结果:已知COS-7细胞不表达Keap1,转染pIRES-EGFP-Keap1后,免疫印迹显示Keap1蛋白表达明显增加,提示载体构建和转染成功.细胞迁移实验显示Keap1过表达使COS-7细胞迁移能力明显下降,过表达Keap1的COS-7和A549细胞内F-actin纤维束增多、增粗、增长,交错排列横穿整个胞质;对照组束状F-actin纤维较少且短,在细胞质散在分布.结论:Keap1过表达能够促进细胞内应力纤维形成,增加细胞骨架稳定性,发挥抑制细胞运动的作用.
-
皮层肌动结合蛋白不同位点磷酸化对人气道上皮细胞黏蛋白5AC分泌的影响
目的:了解皮层肌动结合蛋白(cortical actin-binding protein,又称cortactin)在人气道上皮细胞黏蛋白(mucin,MUC)5AC分泌中的作用及不同磷酸化位点对其的影响.方法:培养人气道上皮细胞HBE16,以皮层肌动结合蛋白不同磷酸化位点突变载体转染细胞,并分为空白对照组、剪应力刺激组、剪应力+增强绿色荧光蛋白质粒(enhanced green fluorescent protein plasmid,pEGFP)-N1组、剪应力+pEGFP-N1-cortactin (Cort)组、剪应力+pEGFP-N 1-Cort-Y421A组、剪应力+pEGFP-N 1-Cort-Y470A组及剪应力+pEGFP-N1-Cort-Y486A组,剪应力设定为4 dynes/cm2.采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、real-time PCR法测定转染前后各组细胞及培养上清中MUC5AC蛋白和mRN水平,Western印迹检测各组皮层肌动结合蛋白及磷酸化皮层肌动结合蛋白含量;异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的鬼笔环肽染色观察丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)的分布情况.结果:4 dynes/cm2剪应力刺激30 min后,细胞中磷酸化皮层肌动结合蛋白表达增加,在2h时表达水平高;剪应力刺激2h后,MUC5AC mRN表达增强,细胞及培养上清中MUC5AC的含量与空白对照组相比,各组均显著增加(均P＜0.05);与剪应力刺激组相比,剪应力+pEGFP-N 1-cortactin(Cort)组的细胞培养上清液中MUC5AC蛋白含量显著增加,F-actin在胞膜的分布也明显增多(均P＜0.05),而胞质内MUC5AC蛋白及MUC5AC mRN水平变化不大.与剪应力+pEGFP-N1-Cort组相比,剪应力+pEGFP-N1-Cort-Y421A组、剪应力+pEGFP-N 1-Cort-Y470A组培养上清液中的MUC5AC蛋白含量有明显降低,F-actin在胞膜的聚集也有所减少(均P＜0.05),而剪应力+pEGFP-N1-Cort-Y486A中MUC5AC含量变化不明显(P＞0.05).结论:皮层肌动结合蛋白参与了剪应力诱导产生的人气道上皮细胞MUC5AC蛋白分泌,Tyr421和Tyr470位点磷酸化在其中可能起重要的作用.
-
胶质瘤细胞MMP-2和F-actin含量分析及其与侵袭性的关系
目的 分析胶质瘤细胞分泌基质金属蛋白-2(MMP-2)水平和丝状肌动蛋白(F-actin)的含量,探讨胶质瘤细胞迁移与溶解基质的能力及其与侵袭性的关系.方法 分别用流式细胞术、免疫细胞化学法和transwell体外侵袭实验检测胶质瘤细胞和星形胶质细胞F-actin的含量、MMP-2蛋白的表达水平及侵袭力的强弱,并对两种细胞进行比较分析.结果 胶质瘤细胞F-actin的含量(202.54±11.06)明显高于星形胶质细胞F-actin的含量(62.64±10.23),两者比较有显著性差异(t=-26.258,P=-0.000);胶质瘤细胞MMP-2的表达呈阳性或强阳性,星形胶质细胞MMP-2的表达呈阴性或弱阳性,两组MMP-2阳性表达率分别为96.11%及15.05%,比较有显著性差异(P=-0.000);胶质瘤细胞的侵袭力(246.97±54.48)明显强于星形胶质细胞的侵袭力(39.77±11.46),两组比较有显著性差异(t=20.376,P=0.000).结论 胶质瘤细胞含有大量的F-actin及分泌大量的MMP-2蛋白,高F-actin含量与大量MMP-2蛋白分泌与肿瘤细胞强侵袭力有关.
-
静水压联合IGF-1干预对山羊颞下颌关节盘细胞丝状肌动蛋白表达影响的实验研究
目的 探讨静水压联合IGF-1对体外单层培养的山羊颞下颌关节盘细胞丝状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)的影响,分析静水压、IGF-1与F-actin的关系变化对细胞生物学行为改变的影响.方法 取4只1月龄山羊双侧颞下颌关节盘,采用酶消化法分离培养颞下颌关节盘细胞,以Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定.取第2、3代细胞根据干预方法不同分为4组:A组以完全培养基培养,作为对照;B组以强度0.2 MPa、频率1Hz的静水压作用3 h;C组以含10 ng/mL IGF-1的完全培养基培养;D组采用静水压与IGF-1联合培养,方法同B、C组.于干预后24、72 h行免疫荧光染色观察F-actin变化,测定单个细胞荧光强度.结果 经形态学观察及免疫组织化学染色鉴定,所培养细胞为颞下颌关节盘细胞.干预24 h时A、C组细胞荧光染色强,保持了细胞正常形态,且分布清晰;B组F-actin排列紊乱;D组F-actin变细,排列混乱.72 h时A、C组F-actin排列整齐;B组F-actin排列紊乱、模糊不清,部分F-actin断裂,形成伪足;D组F-actin变细,排列紊乱、断裂.随时间延长,A、B、D组荧光强度均呈增强趋势,两时间点间比较差异有统计学意义(P＜0.05);C组两时间点间比较差异无统计学意义(t=0.284,P=0.781).干预24 h,C组荧光强度高,B组低,与A、D组比较差异均有统计学意义(P＜ 0.05).72h时,B、D组荧光强度显著低于A、C组,差异有统计学意义(P＜0.05);B、D组间及A、C组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 静水压可以引起山羊颞下颌关节盘细胞F-actin发生断裂及重排,IGF-1上调F-actin的表达;静水压联合IGF-1诱导产生的F-actin断裂、重排可能引起细胞生物学行为的改变.
-
周期性张应力作用下成骨样细胞MG-63中c-fos基因和丝状肌动蛋白相互关系的研究
目的 探讨成骨样细胞MG-63中c-fos基因和细胞骨架丝状肌动蛋白(F-actin)的相互关系.方法 对MG-63细胞施加周期性张应力,频率为0.5 Hz,细胞应变为2000 μstrain,按3、6、12h不同时间段进行加载,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测c-fos mRNA的变化,筛选佳加载时间点,并作为实验组和0h组进行对比,检测在细胞松弛素D作用下c-fos mRNA和F-actin的表达变化.结果 周期性张应力可以诱导c-fos mRNA的表达增加,至3h达到峰值；在周期性张应力作用下,MG-63细胞中F-actin的结构、排列发生改变,但荧光强度无明显变化；经细胞松弛素D处理后,张应力作用下的MG-63细胞的应力纤维明显减少,F-actin荧光强度降低,c-fos mRNA表达受抑制.结论 周期性张应力作用下,F-actin的量并没有明显变化,只是出现了结构上的重组,且重组的是既有的F-actin.F-actin重组是应力诱导c-fos基因高表达的一个重要环节.
