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MRF4转染对横纹肌肉瘤RD细胞分化及生肌调节因子表达的影响
为观察MRF4转染对人横纹肌肉瘤RD细胞分化及生肌调节因子MyoD表达的影响,利用脂质体法将MRF4转染人横纹肌肉瘤RD细胞,原位杂交检测MRF4、MyoD mRNA的表达,观察细胞形态、生长速度变化,并采用免疫细胞化学方法检测横纹肌肌球蛋白重链及肌动蛋白α-actin表达.结果显示,转染后RD细胞形态向高分化方向变化,生长受抑;MRF4、MyoD表达明显增加;细胞肌球蛋白重链和肌动蛋白α-actin表达显著增强.提示MRF4具有促进RD细胞分化的作用,并可激活另一生肌调节因子MyoD的表达.
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异氟醚麻醉对新生大鼠海马激活肌细胞增强因子2信号通路的影响
目的 探讨异氟醚麻醉对新生大鼠海马激活肌细胞增强因子2(MEF2)信号通路的影响.方法 取出生5 d的SD大鼠24只,雌雄不拘,体重10～13 g,采用随机数字表法,将大鼠随机分为2组(n=12):对照组(C组)和异氟醚组(I组).I组大鼠放置在密闭箱中,吸人1.5%异氟醚和纯氧,吸入时间6 h,C组不做任何处理.于异氟醚麻醉2、4、6 h和麻醉结束后24 h(T1-4)时(C组于相应时点)分别取3只大鼠,断头处死,取海马组织,采用RT-PCR法测定MEF2mRNA、synGAPⅠ mRNA和Arc mRNA及突触素Ⅰ mRNA的表达水平,采用Westrn blot法测定突触素Ⅰ蛋白的表达水平.结果 与C组比较,I组T1-3时海马MEF2mRNA、synGAP Ⅰ mRNA、Arc mRNA和突触素Ⅰ mRNA、T2-4时海马突触素Ⅰ蛋白表达水平均上调(P＜0.05).结论 吸入麻醉浓度的异氟醚可能通过激活新生大鼠海马MEF2信号通路从而影响发育期突触的形成.
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大鼠肌细胞生成素基因的克隆
目的设计特异引物克隆大鼠肌细胞生成素(myogenin)的cDNA.方法用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)合成myogenin cDNA;经提纯后,连接到克隆载体pGEM-T,形成重组的克隆载体pGEMT-myogenin. pGEMT-myogenin转化大肠杆菌Ecoli.DH5α内扩增;提取、纯化的pGEMT-myogenin, 经酶切、PCR鉴定及DNA测序,来判断所克隆myogenin cDNA的正确性.结果 RT-PCR产物经凝胶电泳鉴定,含有大小正确的DNA 片段;提取、纯化的pGEMT-myogenin质粒经限制性内切酶酶切、PCR鉴定,含有大小正确的DNA片段,且该片段含有所设计的酶切位点.DNA测序结果证实所克隆的myogenin cDNA序列正确.结论该研究成功地克隆了myogenin cDNA.
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大鼠失神经不同时相的骨骼肌形态和MyoD表达变化
目的：研究大鼠失坐骨神经后MyoD在腓肠肌中不同时相的表达变化，进一步探讨骨骼肌失神经后再生修复机制。方法将48只2月龄SD雄性大鼠随机分为八组，每组6只。其中正常对照和失神经各四组，于术后2、7、14、28 d取材，分别标记为Z1、Z2、Z3、Z4组和S1、S2、S3、S4组。在相应的时相内取各组大鼠左、右后肢的腓肠肌测肌湿重后冻存以备后续实验。计算各组腓肠肌湿重比及其肌腹段HE染色后的横截面积，Western blotting检测MyoD在腓肠肌的表达。结果手术组失神经侧（S1F右、S2F右、S3F右、S4F右）大鼠腓肠肌湿重逐渐减小，且各时相肌湿重比比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；HE染色后腓肠肌的各时相平均横截面积逐渐减小，即各时相组内与组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Western blotting检测各时相失神经侧较正常对照组腓肠肌的MyoD表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论大鼠腓肠肌失坐骨神经后第1周内出现明显肌萎缩现象，且萎缩速度在失神经前2周较快；MyoD蛋白在大鼠失坐骨神经后的表达增加，在失神经第2周时其表达量高，随后开始降低，但仍高于正常大鼠。
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早期肌肉特异性mRNA在骨髓干细胞的表达
目的:研究早期肌肉特异性mRNA在骨髓干细胞中的特异性表达.方法:利用RT-PCR研究不同时期C57鼠和不同代龄SD大鼠骨髓干细胞早期肌肉特异性mRNA(包括MyoD,Myf5,myogenin,MRF4和desmin)的表达.结果:Myf5及desmin在新鲜分离、培养了2 d和7 d的悬浮与贴壁的C57小鼠骨髓干细胞中均有表达,没有检测到MyoD,myogenin和MRF4在此时期小鼠骨髓干细胞的表达.MyoD与desmin在原代至第6代SD大鼠骨髓间质干细胞中均有表达,没有检测到myogenin和MRF4在各代细胞中的表达.结论:骨髓干细胞能表达一定水平的早期肌肉特异性mRNA.
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5-氮杂胞苷诱导间充质干细胞分化为成肌细胞的实验研究
目的探讨5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导间充质干细胞(MSCs)分化为成肌细胞的相关机制. 方法分离纯化4～6周龄Balb/C小鼠骨髓MSCs,以不同浓度5-Aza作用,用四唑盐(MTT)法测定细胞生长活力;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定肌形成调节因子5(Myf5)、成肌素(myogenin)表达;免疫组织化学染色鉴定结蛋白(desmin)、肌凝蛋白(myosin)表达;观察细胞形态变化. 结果 1, 3 μmol/L 5-Aza对细胞增殖无明显影响,20 μmol/L 5-Aza对细胞有毒性作用,影响其增殖.10 μmol/L 5-Aza诱导后6 h,MSCs表达Myf5,9 h达高;5 μmol/L 5-Aza诱导后9 h,MSCs表达Myf5,12 h达高峰.10 μmol/L 5-Aza诱导后24 h,MSCs表达myogenin,48 h达高;5 μmol/L 5-Aza诱导后6 d,MSCs表达myogenin,且为高峰.10 μmol/L 5-Aza诱导后7 d,部分细胞表达desmin;14 d部分细胞表达myosin.10 μmol/L 5-Aza诱导后9 d,部分细胞胞体明显增粗,14～16 d后可见有肌管样细胞出现. 结论 5-Aza诱导MSCs向成肌细胞定向分化,可能是因其产生的去甲基化作用使MSCs中处于转录失活阶段的肌分化调控基因Myf5等得以表达,从而调控MSCs向肌细胞系定向分化并逐步表达myogenin,后分化为肌管样细胞的过程.
