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电针联合跑台训练对大鼠骨骼肌钝挫伤的修复作用
目的:观察电针联合跑台训练对大鼠骨骼肌钝挫伤的修复作用,探讨电针联合跑台训练改善骨骼肌损伤的可能机制.方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、电针组、跑台组和联合组,每组12只.采用自制打击装置建立骨骼肌钝挫伤模型.电针组电针“足三里”、阿是穴,跑台组进行跑台训练,联合组同时进行电针和跑台训练,1次/d,连续至损伤后3、14 d.HE染色观察损伤后14 d腓肠肌新生肌细胞横截面积和直径,Western blot法检测损伤后3d腓肠肌哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、肌细胞生成素(myoG)和14 d腓肠肌mTOR、快肌型骨骼肌肌球蛋白重链(Fast MyHC)的表达量.结果:模型组新生肌细胞横截面积和直径明显小于正常组(P＜0.01),各治疗组均显著大于模型组(P＜0.05),联合组显著大于电针组和跑台组(P＜0.05).与正常组比较,损伤后3d模型组腓肠肌mTOR和myoG蛋白表达均显著升高(P＜0.01);与模型组比较,各治疗组腓肠肌mTOR和myoG蛋白表达均显著升高(P＜0.01);与电针组比较,跑台组腓肠肌mTOR和myoG蛋白表达均显著降低(P＜0.01);与电针组和跑台组比较,联合组腓肠肌mTOR和myoG蛋白表达显著升高(P＜0.05,P＜0.01).与正常组比较,损伤后14 d模型组腓肠肌mTOR蛋白表达升高,但差异无统计学意义(P＞0.05),Fast MyHC蛋白表达显著降低(P＜0.01);与模型组比较,各治疗组腓肠肌mTOR及Fast MyHC蛋白表达均显著升高(P＜0.05,P＜0.01);与电针组比较,跑台组腓肠肌mTOR及Fast MyHC蛋白表达均显著降低(P＜0.05,P＜0.01);与电针组和跑台组比较,联合组腓肠肌mTOR及Fast MyHC蛋白表达均显著升高(P＜0.01).结论:电针联合跑台训练能促进成肌细胞分化成熟,减轻骨骼肌损伤,该作用与增加mTOR表达量,正向调控myoG、Fast MyHC的表达有关.
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PI3K/Akt/mTOR信号通路在大鼠急性骨骼肌钝挫伤修复中的作用
目的:研究PI3K/Akt/mTOR信号通路在大鼠急性骨骼肌钝挫伤修复中的作用及变化趋势,探讨骨骼肌损伤修复的可能生物学机制.方法:SD大鼠随机分为正常对照组和损伤后1d组、3d组、5d组、7d组、14 d组,每组各6只,采用自制打击装置建立腓肠肌钝挫伤模型.HE染色观察各组腓肠肌的形态结构;免疫印迹检测各组腓肠肌中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的蛋白激酶B (P-AktSer473)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(P-mTORSer2448)的蛋白表达量;逆转录实时定量聚合酶链反应检测腓肠肌中成肌分化抗原(MyoD)、肌细胞生成素(MyoG)的mRNA相对表达量.结果:(1)HE染色结果显示:损伤后1d可见肌细胞变性坏死,炎性细胞浸润;损伤后3d和5d可见新生的成肌细胞和肌管;损伤后7d和14 d可见新生肌细胞和胶原纤维.(2)免疫印迹结果显示:与正常对照组比较,损伤后1d、3d、14 d组的各蛋白表达量升高,差异无统计学意义(P＞0.05);损伤后5d组PI3K、Akt、P-AktSer473表达量显著升高(P＜0.01),mTOR和P-mTORSer2448表达量显著升高(P＜0.05);损伤后7d组PI3K、P-AktSer473、mTOR、P-mTORSer2448表达量显著升高(P＜0.05),Akt表达量显著升高(P＜0.01).(3)逆转录实时定量聚合酶链反应结果显示:与正常对照组比较,损伤后1d组MyoD1和MyoG的mRNA表达量显著升高(P＜0.05,P＜0.01);损伤后3d、5d、7d各组MyoD1和MyoG的mRNA表达量显著升高(P＜0.01);损伤后14 d组MyoG的mRNA表达量显著升高(P＜0.05),MyoD1的mRNA表达量升高,但无统计学意义(P＞0.05).结论:PI3K/Akt/mTOR信号通路具有时间规律性地正向调控骨骼肌钝挫伤后的自我修复,可以作为临床治疗及科学研究骨骼肌损伤的靶点.
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蝙蝠葛碱促进大鼠成肌细胞分化成熟及可能机制
目的 探讨蝙蝠葛碱对成肌细胞分化成熟的促进作用及可能机制.方法 培养正常大鼠的成肌细胞系(L6)在含有100ng/mL蝙蝠葛碱的培养基中,21d后,通过相差显微镜观察细胞形态的变化和肌管的形成,采用RT-PCR分析肌红蛋白(MyoD)家族中肌细胞生成素(Myogenin)和肌细胞调节因子4(muscle-specific regulatory factors 4,MRF4) mRNA的表达,采用Western-blot检测Myogenin蛋白的表达.结果 随着培养时间的延长,分散的梭形成肌细胞相互聚集,逐渐形成双核连肌管和多核连肌管并产生自律性收缩.暴露于蝙蝠葛碱后,成肌细胞聚集融合形成的肌管数目明显增加,肌管直径显著增大,并产生明显的自律性收缩(未见于同期对照组).RT-PCR和Westemn Blot测表明,成肌细胞的Myogenin和MRF4的表达水平在培养5d后达到峰值.蝙蝠葛碱处理后,Myogenin峰值表达水平持续时间显著延长,MRF4表达高峰出现延迟但表达量明显升高.结论 蝙蝠葛碱可促进大鼠肌细胞分化成熟.
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大鼠肌细胞生成素基因的克隆
目的设计特异引物克隆大鼠肌细胞生成素(myogenin)的cDNA.方法用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)合成myogenin cDNA;经提纯后,连接到克隆载体pGEM-T,形成重组的克隆载体pGEMT-myogenin. pGEMT-myogenin转化大肠杆菌Ecoli.DH5α内扩增;提取、纯化的pGEMT-myogenin, 经酶切、PCR鉴定及DNA测序,来判断所克隆myogenin cDNA的正确性.结果 RT-PCR产物经凝胶电泳鉴定,含有大小正确的DNA 片段;提取、纯化的pGEMT-myogenin质粒经限制性内切酶酶切、PCR鉴定,含有大小正确的DNA片段,且该片段含有所设计的酶切位点.DNA测序结果证实所克隆的myogenin cDNA序列正确.结论该研究成功地克隆了myogenin cDNA.
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大鼠肌细胞生成素基因真核表达载体的构建
目的构建骨骼肌肌细胞生成素(myogenin)基因真核表达载体,深入探讨在骨骼肌损伤及骨骼肌失神经萎缩的发生、发展过程中的变化规律,以及病理过程. 方法含myogenin cDNA的克隆载体pGEMT-myogenin经限制性内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切,得到含这两个酶切位点之myogenin cDNA片段,T4连接酶连接到含有这两个酶切位点的真核表达载体pcDNA3,构建出重组真核表达载体pcDNA3-myogenin,经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性. 结果经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实:pcDNA3-myogenin含大小正确的myogenin cDNA片段,DNA测序证实其DNA序列正确. 结论成功地构建了肌细胞生成素基因真核表达载体pcDNA3-myogenin.
