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小鼠FABP3基因全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达
目的 克隆小鼠FABP3基因的全长cDNA,构建其真核表达载体,并于COS-7细胞内表达.方法 利用PCR技术扩增小鼠FABP3基因的开放阅读框序列,并在3'末端连接24bp的Flag标签,克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建表达质粒pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并行PCR、双酶切及测序鉴定.将构建的重组质粒通过脂质体转染COS-7细胞,分别采用RT-PCR和免疫荧光法检测其FABP3 mRNA及蛋白的表达情况.结果 所构建的pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag重组载体可酶切出418bp的FABP3 eDNA片段和442bp的FABP3-Flag cDNA片段,经测序证实正确.转染后的COS-7细胞经RT-PCR可扩增出278bp的目的 片段,且免疫荧光分析可见特异性的FABP3及Flag蛋白表达.结论 构建了FABP3基因真核表达载体pcDNA3.1-FABP3和pcDNA3.1-FABP3-Flag,并于COS-7细胞中成功转录表达,为后续研究奠定了基础.
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丙型肝炎病毒NS3不同末端在COS、NIH3T3细胞中的转录与表达
目的:建立丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的COS和NIH 3T3的细胞系表达系统,以探讨其慢性化及肝癌的发病机理.方法:用脂质体共转录法,将含有丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的重组质粒pSG 5 neo转录至COS和MH 3T3细胞系中表达,并用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和Southern blot法在DNA水平检测.用Western blot法在蛋白水平检测.结果:在转录的COS和MH 3T3的细胞系中,存在有丙型肝炎病毒NS 3在3和5基因片段,并可表达相应的抗原.结论:此表达细胞系的建立,有利于对丙型肝炎病毒的复制,丙型肝炎慢性化及肝癌发病的研究.
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新型白蛋白微泡经超声介导破裂促进EGFP基因在Cos-7细胞的表达
目的根据超声介导白蛋白微泡破裂空化效应可以增加真核细胞膜对大分子(如DNA)通透性的原理,探讨一种新的转基因方法,以便安全有效和定向地转移目的基因.方法实验中选择绿色荧光蛋白基因EGFP为标记基因,以自制的白蛋白微泡为载体,用超声介导微泡破裂的方法在体外进行CoS-7细胞的基因转化,同时以脂质体为对照,激光共聚焦显微镜和流式细胞计数仪分别定性和定量观察细胞转化效率.锥虫蓝染色观察细胞的活性.结果体外试验发现0.8 MHz、1.0 W/cm2、10%占空比(dutycycle)、60 s超声介导10%白蛋白微泡破裂可以有效稳定地转化EGFP基因在Cos-7细胞表达,且对细胞无毒副作用.结论自制白蛋白微泡是一种安全、有效的新型基因载体,在一定超声条件控制下,能增强基因的转导与表达,有良好的靶向性,提示该技术有应用于临床基因治疗的广阔前景.
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周期型马来丝虫副肌球蛋白基因真核表达重组质粒构建
提取周期型马来丝虫总RNA.跟据已知的马来丝虫副肌球蛋白(BmPmy)基因序列,设计合成引物,并引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点,应用RT-PCR技术,扩增BmPmy基因片段,克隆至载体pGEM-T中,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-BmPmy,并转染COS-7细胞后进行RT-PCR分析.转染的COS-7细胞高水平表达周期型马来丝虫副肌球蛋白mRNA,结果与预期相符.
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人瘦素的基因克隆及其在COS-7细胞中的表达
目的构建重组人瘦素哺乳细胞表达载体并在COS-7细胞表达重组人瘦素.方法提取脂肪细胞总RNA,用RT-PCR扩增人瘦素cDNA并克隆至载体pUCm-T,并对克隆基因进行DNA序列分析.以克隆的人瘦素cDNA为模板,用特异引物扩增瘦素基因,经KpnI和BamH I酶切,插入相应酶切的哺乳细胞表达载体pcDNA3,构建重组哺乳细胞表达载体并转染COS-7细胞,RT-PCR和Western印迹检测其在COS-7细胞中的表达.结果 RT-PCR扩增的DNA片断和预期的人瘦素cDNA大小一致;序列分析显示,克隆的基因序列和文献报道的人瘦素基因序列一致;经RT-PCR和Western印迹鉴定,转染的COS-7细胞可表达、分泌人瘦素.结论构建了人瘦素的哺乳动物细胞表达载体,并成功地在COS-7细胞中获得重组人瘦素的分泌表达.
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促黄体生成素基因免疫对前列腺增生模型鼠生殖内分泌的影响
目的探讨LH基因免疫对前列腺增生模型鼠生殖内分泌的影响.方法 RT-PCR法从雌性大鼠垂体细胞中RNA扩增大鼠的促黄体素基因(LH)cDNA片段约(461bp)并克隆至T载体,获得重组质粒T-LH,限制酶酶切,酶连接,构建PCDNA3.1(-)/HbsAg/LH,经脂质体转染纯化的重组质粒至COS细胞中.通过肌肉注射构建的PCDNA3.1(-)/HbsAg/LH与前列腺增生大鼠,2个月内给药两次.结果体外培养COS细胞,发现HBsAg与LH连接物表达较好,肌肉注射前列腺增生模型鼠重组质粒后,模型鼠LH与T的含量明显低于对照组.结论PCDNA3.1(-)/HbsAg/LH可参与前列腺增生模型鼠生殖内分泌腺的调节.
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小鼠 miR-214真核表达载体的构建及其鉴定
目的：构建小鼠 miR-214的 pcDNA3．1（＋/-）真核表达载体并在 COS -7细胞中转染检测其表达。方法小鼠基因组 DNA 扩增得到 miR -214序列，将酶切后的 miR -214克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋/-），重组 pcDNA3．1（＋/-）-miR-214经过酶切和测序鉴定后转染 COS-7细胞并应用萤光定量 PCR 法检测 miR-214表达水平。结果小鼠 miR-214真核表达载体序列分析完全正确；转染 COS-7细胞后miR-214的表达水平可增加1．41倍。结论成功构建了 pcDNA3．1（＋/-）-miR-214真核表达载体并能在真核细胞中进行表达，为进一步进行 miR-214的功能研究提供了实验基础。
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人PTP1B真核载体在COS-7细胞中的表达及其体外抑制剂实验
目的 构建人蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B并在猴肾成纤维细胞COS-7中稳定表达,分离纯化表达的重组融合蛋白,进行酶活性测定及抑制剂的初步实验.方法 应用RT-PCR从2型糖尿病患者的外周血总RNA中扩增出PTP1B cDNA全长序列,并在基因上下游分别引入BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ两个酶切位点,酶切后定向导入pcDNA3.1/Hismyc-B多克隆位点,构建真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B,转染COS-7细胞,G-418筛选2周后取细胞裂解上清液经Ni2+亲和层析柱纯化后,测定了其酶活性及小分子抑制剂钒酸钠的IC50.结果 从2型糖尿病患者外周血中扩增得到1 301 bpPTB1B cDNA全长序列,经双酶切鉴定及测序分析,表明hPTP1B已克隆到poDNA3.1/Hismyc-B中.RT-PCR和免疫印迹表明转染成功.酶活性实验初步显示rhPTP1B的活性随酶浓度增加而增加,随PTP1B的特异性抑制剂钒酸钠的浓度增加而减少.结论 获得具有酶活性的融合蛋白rhPTP1B,为进一步筛选其特异性抑制剂奠定基础.
关键词： 蛋白质酪氨酸磷酸酶/拮抗剂和抑制剂 COS细胞 基因表达 遗传载体 -
香烟提取物对 COS-7细胞表面血栓调节蛋白荧光表达的影响
目的：探讨香烟提取物（CSE）是否对非洲绿猴肾成纤维细胞（COS-7）表面血栓调节蛋白（TM）荧光蛋白表达的影响。方法：成功构建TM-绿色荧光蛋白（GFP）质粒后，使其转染至COS-7细胞，用制备好的5％ CSE孵育（5％ CSE组）；将无血清低必需培养基（MEM ，单纯培养基）加入一定体积的PBS进行同步培养作为对照组；采用流式细胞仪计数方法检测不同时间点COS-7表面TM荧光蛋白表达量的变化。结果：与对照组比较，5％CSE在1h、6h对COS-7表面TM荧光蛋白表达没有明显变化[1h ：（134.99±18.41）比（146.61±12.06），6h （116.89±27.28）比（123.89±39.24）， P均＞0.05]。结论：5％香烟提取物对非洲绿猴肾成纤维细胞表面血栓调节蛋白荧光表达没有影响。
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重组人Wnt10b蛋白的制备及其促进子鼠皮肤β-连环蛋白的表达
目的 基因工程制备重组人Wnt10b蛋白,观察其促进子鼠皮肤β-连环蛋白的表达.方法 以pUC19-Wnt10b为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增cDNA,扩增产物和pEGFP-N1载体双酶切,连接酶连接构建pEGFP-N1-Wnt10b真核表达载体,酶切和测序鉴定该载体；LpofectamineTM 2000将该载体转染入COS-7细胞,计算转染率.Western blot和免疫细胞化学法检测COS-7细胞Wnt10b蛋白表达；将子鼠背部皮肤置于含Wnt10b蛋白的培养液中培养2d,Western blot法检测皮肤Wnt10b和β-连环蛋白的表达.结果 PCR扩增出的人Wnt10b基因cDNA正确克隆到pEGFP-N1载体,成功构建pEGFP-N1-Wnt10b；pEGFP-N1-Wnt10b,成功转染COS-7细胞,转染率为20％ ～ 40％,转染后COS-7细胞Wnt10b蛋白表达较对照组增加(P＜0.05),COS-7细胞分泌的Wnt10b蛋白能促进子鼠皮肤β-连环蛋白的表达(P＜0.05).结论 成功制备具有生物活性的重组人Wnt10b蛋白,Wnt10b蛋白促进子鼠皮肤β-连环蛋白的表达增加.
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带信号肽人胰岛素原突变体的构建及在COS-7细胞中的表达
目的:构建带信号肽人胰岛素原突变体的真核表达载体并在COS-7细胞表达出成熟的人胰岛素.方法:采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM),将普通细胞内furin蛋白酶的识别和切割位点Arg-X-Lys-Arg-样序列,引入人胰岛素原C肽两端,同时加上信号肽、Kozak序列和限制性内切酶的酶切位点并克隆至载体pcDNA3.1(+)中,构建成人胰岛素原突变体的真核表达载体,经测序验证后转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹、放射免疫法检测其在COS-7细胞中的表达.结果:DNA测序结果表明在预期位点突变符合要求,经RT-PCR、Western印迹、放射免疫鉴定,构建的人胰岛素原突变体的真核表达载体转染的COS-7细胞可表达、分泌人成熟胰岛素.结论:构建了人胰岛素原突变体的真核表达载体,并成功地在COS-7细胞中获得人胰岛素的分泌表达.
